靶向PKCα的反义核酸和siRNAs对肺癌A549细胞的作用

论文摘要

目的:探讨聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）介导的人蛋白激酶Cα（proteinkinase Cα,PKCα）基因反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响;筛选靶向PKCα的有效siRNAs序列,并检测其对A549细胞的作用,以期为PKCα反义核酸和PKCαsiRNAs应用于肺癌的基因治疗提供实验依据。方法:第一部分探讨PEI介导的人PKCαASODN对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响1.采用改良MTT法（WST法）和克隆形成抑制实验分析细胞生长增殖结果。2.流式细胞术（PI单染色和Annexin V+PI双染色）检测细胞凋亡。3.Hoechst33258染色和透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。4.RT-PCR和Western blot检测PKCα的表达水平。第二部分筛选靶向PKCα的有效siRNAs序列,并检测其对A549细胞的作用1.根据siRNA设计原则,综合利用多种siRNA设计软件,设计出6条靶向PKCα的siRNAs序列,blast排除同源序列,候选序列交由公司化学合成。同时化学合成阴性对照siRNA和阳性对照siRNA。2.以法国Polyplus Transfection公司的siRNA转染试剂InterferinTM介导siRNAs转染A549细胞,通过WST法及RT-PCR筛选出有效的siRNAs序列。3.将3条效果较好的PKCαsiRNAs进一步转染A549细胞,采用克隆形成抑制实验检测A549细胞的克隆形成能力的变化;Hoechst33258染色观察凋亡细胞的形态学改变;PI单染流式细胞术检测细胞亚二倍体峰;Annaxin V/PI双染流式细胞术检测细胞早期凋亡率;Western blot检测细胞PKCα的蛋白水平。结果:第一部分:1,PEI介导的PKCαASODN转染A549细胞后,细胞生长增殖和克隆形成均显著被抑制（P＜0.05）,并呈浓度依赖关系。2.流式细胞术显示:空白对照组、PEI组、PEI介导的随机寡核苷酸（randomoligodeoxynucleotide,RODN）组亚二倍体百分率分别为2.0±0.1,4.5±0.3,5.8±0.7,而PEI介导的PKCαASODN（1.5μmol/L）转染组亚二倍体百分率为13.3±1.2（P＜0.05）;空白对照组、PEI组、PEI介导的RODN组早期凋亡细胞百分率分别为2.7±0.5,2.8±0.2,3.0±0.4,而PEI介导的PKCαASODN（1.5μmol/L）转染组早期凋亡细胞百分率为17.1±1.0（P＜0.05）。3.Hoechst33258染色和电镜检测均可见PEI介导的PKCαASODN转染组A549细胞有核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化。4.RT-PCR和Western blot结果均表明:PEI介导的PKCαASODN转染A549细胞能明显下调PKCα的表达,与空白对照组、PEI或PEI介导的RODN转染组相比,有统计学意义（P＜0.05）。第二部分:1.设计出6条PKCαsiRNAs,分别命名为No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6PKCαsiRNA。2.WST法结果显示:6条PKCαsiRNAs（50 nmol/L）转染A549细胞48h后,除No.5siRNA外均显著地抑制了A549细胞增殖,与空白对照组,转染试剂InterferinTM对照组和阴性对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。3.RT-PCR检测显示:与空白对照组,转染试剂InterferinTM对照组和阴性对照组相比,6条PKCαsiRNAs（50 nmol/L）转染A549细胞48 h均显著下调了PKCαmRNA水平（P＜0.05）。4.综合以上WST法和RT-PCR两实验结果,筛选出3条效果较好的PKCαsiRNAs序列,依次为No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNA。5.克隆形成抑制实验显示:1nmol/L No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs转染A549细胞7天,克隆形成明显受抑,抑制率（%）分别为69.44±4.12,56.82±4.95,49.75±3.21,与空白对照组,转染试剂InterferinTM对照组和阴性对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。6.Hoechst 33258染色可见50nmol/L No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs转染A549细胞48h均出现了核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化。7.流式细胞术显示:与空白对照组、转染试剂InterferinTM对照组和阴性对照组相比,50nmol/L No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs转染组A549细胞亚二倍体百分率和早期凋亡细胞比例均明显增高（P＜0.01）。8.Western blot结果表明:50nmol/L No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs转染A549细胞72h均明显下调了PKCα蛋白的表达,与空白对照组、转染试剂InterferinTM对照组和阴性对照组相比,有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.PEI介导的PKCα反义寡核苷酸能下调PKCα基因的表达,显著抑制A549细胞增殖和克隆形成,并诱导A549细胞凋亡。2.本实验中设计的6条PKCαsiRNAs都能下调PKCα基因的mRNA水平,抑制A549细胞增殖,其中No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs效果较好。No.3、No.6、No.1 PKCαsiRNAs均能显著地抑制A549细胞克隆形成和PKCα蛋白的表达,并诱导A549细胞凋亡。3.PKCαsiRNAs的有效作用浓度（致A549细胞增殖抑制率达50%时的作用浓度为50nmol/L）远低于PKCαASODN（致A549细胞增殖抑制率达50%时的作用浓度约为1.0μmol/L）,可以在低于反义寡核苷酸约20倍的浓度下发挥与反义寡核苷酸相同的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 聚乙烯亚胺介导的人PKC α反义核酸对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 靶向PKC α的有效siRNAs序列的筛选及其对肺癌A549细胞的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 发表文章
• 致谢