基质金属蛋白酶MMP-26基因的克隆与表达

论文摘要

基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）是由细胞分泌的锌离子依赖性的肽内切酶的总称。几乎所有MMPs的催化结构域中都含有一段十分保守的氨基酸序列: HEXGHXXGXXH,其中的三个组氨酸被认为可以与酶活性中心部位的Zn2+结合形成配位键,这个结构对酶的催化活性有重要作用。细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）是由许多生物大分子构成的网络结构。MMPs是ECM降解过程中必不可少的酶,几乎能降解ECM的所有成分。MMPs在正常组织中表达量很少,但是当MMPs的调控机制失去平衡,MMPs活性异常升高时,就会导致一些病理过程的发生。因此,以MMPs为治疗靶点,寻找MMPs的拮抗药物,尤其是MMPs选择性抑制药物,已经成为筛选抗肿瘤药物的热点。MMP-26也叫做endometase和matrilysin-2,最初是从人类子宫内膜肿瘤cDNA文库中克隆出来的。酶原形式具有一个信号肽、前肽结构域和催化结构域。前肽结构域中有一个独特的不同于其他MMPs的半胱氨酸开关PHCGVPD。MMP-26独特的结构特点、性质和功能是分不开的。我们构建了不同的MMP-26原核表达质粒,进一步研究它的表达方式和纯化和复性条件,探讨了目的蛋白的融合蛋白和包涵体两种表达方法,并尝试使用了ELPs沉淀方法纯化ELP-cdMMP-26融合蛋白。我们对表达条件进行了探索,找到了相对合适的诱导表达与提纯复性的条件。通过改变诱导温度和诱导剂的终浓度等条件,使融合的cdMMP-26以可溶形式产生,加入终浓度为2M的NACl缓冲液纯化了融合蛋白。当MMP-26以包涵体形式表达时,我们获得了较纯的有生物活性的MMP-26样品,通过传统的酶谱方法和荧光酶标仪检测荧光淬灭等实验证明了活性的存在,为筛选MMP抑制剂提供了帮助。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写词表
• 第一章 前言
• 1. 基质金属蛋白（MMPs）
• 1.1 细胞外基质概述
• 1.2 基质金属蛋白酶的结构
• 1.3 基质金属蛋白酶的分类
• 1.4 基质金属蛋白酶的底物
• 1.5 基质金属蛋白酶的活性调控
• 1.6 基质金属蛋白酶的功能
• 1.7 基质金属蛋白酶的抑制
• 1.8 MMP-26 简介
• 2. ELPs 简介
• 2.1 ELP 融合表达简介
• 2.2 RDL 法
• 3. 外源蛋白的原核表达
• 3.1 外源蛋白表达系统简介
• 3.2 外源蛋白以包涵体形式表达
• 3.3 外源蛋白以可溶形式表达
• 3.4 活性蛋白的检测
• 4. 本论文的研究目的和策略
• 第二章 ELP-cdMMP-26 融合表达载体的构建
• 1. 实验材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验耗材
• 1.3 实验用细菌株
• 1.4 实验工作液
• 2. 实验方法
• 2.1 ELP60 重组质粒的构建
• 2.2 ELP 基因片段的扩增
• 2.3 pET-32a（+）突变体（Trx-His6）的构建
• 2.4 Trx-cdMMP-26 融合表达载体的构建
• 2.5 Trx-ELP融合蛋白表达载体的构建
• 2.6 Trx-ELP-cdMMP-26 融合蛋白表达载体的构建
• 3. 结果与讨论
• 3.1 ELP 基因重组子的构建
• 3.2 Trx-cdMMP-26 重组质粒的构建
• 3.3 Trx-His6 质粒的构建
• 720重组质粒的构建'>3.4 Trx-ELP360和Trx-ELP₇₂₀重组质粒的构建
• 3.5 Trx-ELP-cdMMP-26 融合表达载体的构建
• 第三章 重组蛋白MMP-26的表达
• 1. 实验材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验耗材
• 1.3 实验菌株
• 1.4 实验工作液
• 2. 方法
• 2.1 ELPs 的诱导表达与纯化
• 2.2 包涵体的表达与纯化
• 2.3 cdMMP-26 和MMP-26 活力检测
• 3. 结果与讨论
• 3.1 ELP 的表达和纯化
• 3.2 cdMMP-26 和MMP-26 包涵体的诱导表达
• 3.3 包涵体的纯化和复性
• 4. 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢