绵羊PGR基因和TTF-1基因多态性研究

论文摘要

本研究以藏羊、滩羊、蒙古羊、小尾寒羊、德国美利奴羊、德克赛尔羊和无角陶赛特羊7个绵羊品种共计427个个体为研究对象，利用PCR-SSCP技术，对PGR基因第4外显子和TTF-1基因第2外显子部分片段进行多态性检测，并采用荧光定量PCR技术，对TTF-1基因在绵羊不同部位的表达量进行了相对定量分析，为研究绵羊繁殖性能分子标记提供资料。（1）PGR基因第4外显子PCR-SSCP检测结果表明：该多态位点由一对等位基因A、B控制，形成AA、BB和AB三种基因型，AA型为优势等位基因型，A为优势等位基因。德国美利奴羊和无角陶赛特羊在此位点没有检测到多态性，其余5个品种杂合度均较低，属低度多态（PIC<0.25）。χ2适合性检验表明，7个绵羊品种在该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。χ2独立性检验结果表明，基因型的分布在藏羊与无角陶赛特羊之间表现为差异极显著（P<0.01）；在无角陶赛特羊与滩羊和蒙古羊之间，德国美利奴羊与藏羊和滩羊之间均表现为差异显著（P<0.05）。测序结果显示在扩增片段的第227bp处（GenBank登录号：Z66555.1第520bp处）发生了C→T的突变，但没有引起氨基酸的突变，属同义突变。（2）TTF-1基因TS1引物片段PCR-SSCP检测表明：该多态位点由三个等位基因A、B、C控制，形成AA、AB、AC三种基因型，AA型为优势等位基因型。测序结果表明是在第二外显子173bp，176bp位点分别发现G→C，G→T突变。在所检测的7个绵羊品种的TTF-1基因TS1片段中仅小尾寒羊、蒙古羊和藏羊发现了多态，且杂合度均非常低，属于低度多态（PIC<0.25）。χ2适合性检验表明，7个绵羊品种在该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。χ2独立性检验结果表明，基因型的分布在小尾寒羊和德克塞尔羊、藏羊两者之间存在差异（P<0.05）。（3）对TTF-1基因mRNA表达的荧光定量PCR检测结果表明：TTF-1基因在大脑、下丘脑、垂体、甲状腺和卵巢五个与青春期发育和繁殖性能有关的组织中均有表达，其中在甲状腺中表达量最高，但表达量在各组织间差异不显著（P>0.05）。

论文目录

• 项目资助
• 摘要
• Summary
• 第一部分 文献综述
• 1 孕酮受体（PGR）基因
• 1.1 PGR 基因概述
• 1.2 PGR 基因的亚型和作用机理
• 1.3 PGR 基因与人类疾病
• 1.4 PGR 基因与动物繁殖机能
• 2 甲状腺转录因子-1（TTF-1）
• 2.1 甲状腺转录因子-1 概述
• 2.2 甲状腺转录因子-1 的结构
• 2.3 甲状腺转录因子-1 的生物学作用
• 2.4 甲状腺转录因子-1 的多态性
• 3 实时荧光定量 PCR
• 3.1 实时荧光定量 PCR 的原理
• 3.2 实时荧光定量 PCR 的分类 I
• 3.3 实时荧光定量 PCR 的分类 II
• 4 研究目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试验主要试剂
• 1.3 溶液的配制
• 1.4 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 绵羊血样的采集
• 2.2 绵羊组织样的采集保存
• 2.3 绵羊血液基因组 DNA 的提取
• 2.4 DNA 检测
• 2.5 PCR 引物的设计
• 2.6 PCR 反应体系和反应程序
• 2.7 PCR 产物的纯化回收
• 2.8 PCR 产物测序
• 2.9 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PCR-SSCP）分析
• 2.11 图像分析
• 2.12 PCR 产物测序
• 2.13 绵羊总 RNA 提取方法
• 2.14 RNA 的纯化
• 2.15 RT 反应
• 2.16 Real Time PCR 条件的优化
• 2.17 实时荧光定量 PCR（Real Time PCR）检测
• 3 数据统计分析及使用的软件
• 3.1 基因频率和基因型频率的计算
• 3.2 遗传多态性分析
• 3.3 Hardy-Weinberg 平衡的检测
• 3.4 基因表达量相对定量计算
• 3.5 主要采用的统计分析工具软件
• 第三部分 试验结果
• 1 绵羊基因组 DNA 的提取及检测结果
• 2 PCR-SSCP 检测和遗传特性分析
• 2.1 PGR 基因多态性检测与遗传特性分析
• 2.2 TTF-1 基因 CDS 序列测序
• 2.3 TTF-1 基因 TS1 引物扩增片段多态性检测与遗传特性分析
• 3 TTF-1 基因表达实时荧光定量 PCR 结果
• 3.1 总 RNA 提取结果
• 3.2 常规 PCR 反应扩增结果
• 3.3 实时荧光定量 PCR 结果
• 3.4 目的基因的表达量
• 第四部分 分析与讨论
• 1 PGR 基因的多态性
• 2 TTF-1 基因的多态性
• 3 TTF-1 基因的表达
• 4 关于实验方法等
• 4.1 血样的采集及 DNA 的提取
• 4.2 实时荧光定量 PCR 引物二聚体荧光值的消除
• 4.3 部分试验工具的制作
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 附录一 本试验所涉及的溶液的配制方法
• 附录二 本试验中用到的主要仪器设备
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介