有机磷农药降解菌的筛选及其特性的初步研究

论文题目: 有机磷农药降解菌的筛选及其特性的初步研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 王华

导师: 黄俊生

关键词: 有机磷农药,生物降解,筛选,鉴定,降解广谱性,小区试验,水解酶

文献来源: 华南热带农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 农药对农业增产的作用是不言而喻的,同样,农药的大量使用所带来的对环境和人类本身的危害也是不容忽视的。有机磷农药曾因毒性低,残留时间短,易挥发、易降解等因素一度受到使用者的青睐,但由于长期大量的使用,仍对环境造成很大危害,因此,研究其污染的治理具有重要意义。有机磷农药降解途径中,生物降解最为重要。本研究从长年施用乐果的土壤中分离筛选出来一批微生物,其中细菌菌株共200多株,真菌共100多株,它们均能在以乐果农药为唯一碳源的培养基上生长。通过进一步的筛选优化,获得5株能在高浓度乐果中生长的细菌,分别编号为L-a,L-b,L-c,L-d,L-e。采用气象色谱法测定上述菌株的降解活性,结果显示该五株细菌均活性较强。其中,48h内L-a共降解乐果648mg/L,L-b共降解乐果1,43 lmg/L,L-c共降解乐果904 mg/L,L-d共降解乐果994mg/L,L-e共降解乐果1,494mg/L。我们对菌株L-b进行深入研究,该菌株能耐受浓度达10,000mg/L的乐果农药,其最适生长温度为28-30℃,在18-42℃的广泛温度范围内仍生长良好,最适生长pH值为7.0左右,同样具有广泛的pH值生长范围(pH6.0-pH9.0)。本实验采用ITS(internal transcribed spacer)菌种鉴定方法,辅以常规鉴定步骤对所研究的菌株进行鉴定。其中ITS序列扩增的引物分别为:16SF:5′ AGTCGTAACAAGGTAGCCGT 3′;23SR:5′GTGCCAAGGCATCCACC 3′。PCR扩增产物克隆测序后登陆 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库检索,检索结果指出所研究菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),即绿脓杆菌。常规鉴定方法显示,该菌株能在绿脓杆菌的鉴定分离培养基(十六烷三甲基溴化铵平板)上生长,革兰氏染色为阴性,氧化酶试验及绿脓菌素试验均为阳性,因此,我们可认为该菌即为绿脓杆菌。初步确定菌株L-b具有广谱的降解有机磷农药的能力,因其在基础培养

论文目录:

1 前言

1.1 化学农药的现状及环境问题

1.1.1 化学农药的生产、使用现状

1.1.2 化学农药与环境问题

1.2 有机磷农药的研究进展

1.2.1 有机磷农药的性质

1.2.2 有机磷农药的生产、使用现状

1.2.3 有机磷农药的环境问题

1.3 有机磷农药在土壤中的降解转化

1.3.1 有机磷农药的水解及反应机制

1.3.2 有机磷农药的光降解

1.3.3 有机磷农药的微生物降解

1.4 微生物降解农药的研究进展

1.4.1 农药降解菌的分离、筛选及降解特性研究

1.4.2 土壤模拟条件下微生物降解农药的特性及影响因素

1.4.3 农药降解菌的应用效果研究

1.5 基因工程技术在降解农药中的应用

1.5.1 利用基因重组技术构建高效降解工程菌

1.5.2 增强工程菌的抗毒能力

1.5.3 利用原生质体融合技术构建降解农药工程菌

1.5.4 工程菌酶制剂和固相反应器的研制

1.6 有机磷农药降解酶的研究进展

1.6.1 有机磷农药降解酶的国外研究进展

1.6.2 有机磷农药降解酶的国内研究进展

1.6.3 酶基因的研究现状

1.6.4 几种有机磷农药降解酶的底物特异性研究

1.6.5 细菌磷酸三酯酶的研究进展

1.7 ITS在菌种鉴定中的应用

1.8 乐果的基本知识

1.9 本研究的立论依据及目的、意义

2 材料和方法

2.1 菌种的分离与筛选

2.1.1 土样来源

2.1.2 供试药剂

2.1.3 培养基

2.1.4 菌株分离方法

2.2 菌株降解能力的测定

2.2.1 仪器

2.2.2 送样制备

2.2.3 GC测定条件

2.3 通过ITS1序列鉴定菌种

2.3.1 试剂与材料

2.4 菌株的常规鉴定试验

2.4.1 培养基

2.4.2 测定方法

2.5 细菌生长相关的生理生化实验

2.5.1 细菌的生长曲线

2.5.2 菌株对农药的耐受性实验

2.5.3 pH对细菌生长的影响

2.5.4 温度对细菌生长的影响

2.6 菌株L-b对底物降解的广谱性

2.6.1 材料

2.6.2 方法

2.7 田间小区试验

2.8 有机磷农药降解酶的初步研究

2.8.1 有机磷农药的酶解反应

2.8.2 降解酶的定位

2.8.3 降解酶的初步纯化

2.8.4 温度对酶活力的影响

2.8.5 pH对酶活力的影响

2.8.6 不同金属离子及化学试剂对该酶活性的影响

2.9 实验仪器

3 结果与分析

3.1 菌株的分离结果

3.2 菌株降解能力的测定

3.3 通过ITS1序列鉴定菌种

3.3.1 gDNA的提取

3.3.2 ITS_1序列的PCR扩增结果

3.3.3 重组质粒的酶切鉴定

3.3.4 序列结果分析

3.4 菌株的的常规鉴定试验

3.5 细菌生长相关的生理生化实验

3.5.1 细菌的生长曲线

3.5.2 菌株农药耐受性实验

3.5.3 培养基pH值对菌体生长的影响

3.5.4 培养温度对菌体生长的影响

3.6 菌株L-b对底物降解的广谱性

3.7 田间小区试验

3.8 有机磷农药降解酶的初步研究

3.8.1 降解酶的初步细胞定位

3.8.2 温度对酶活力的影响

3.8.3 pH对酶活力的影响

3.8.4 不同金属离子及化学试剂对该酶活性的影响

4 讨论

4.1 各乐果降解菌降解能力的比较

4.2 ITS_1序列在菌种鉴定中的应用

4.3 有机磷农药降解酶的纯化

5 结论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-27

参考文献

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