盾壳霉CmRV基因组的全长cDNA克隆及转化ZS-1的研究

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重寄生真菌，在世界范围内广泛分布，在菌核病的生物防治中有着非常重要的作用。真菌病毒CmRV是来自盾壳霉菌株Chy-1的dsRNA病毒，它的全长基因组的序列已被测序完成，属于Totiviridae（全病毒）科，对寄主没有显著的影响。本研究中采用反向遗传学技术对CmRV进行研究，通过分段RT-PCR的方法分别克隆了病毒基因组的5′端和3′端cDNA片段，连接pMD18-T得到病毒全长cDMA的亚克隆，再构建全长克隆的方法得到了含有全长cDNA克隆的重组质粒。在研究过程中发现于2003年测定并提交的CmRV全序列多出了21个碱基，CmRV实际大小为4954nt。由于这21个碱基在3′端的非翻译区，因此并不影响CmRV的分类地位和对其所表达的外壳蛋白（CP）和依赖RNA的RNA聚合酶（RdRP）的推定。通过酶切得到了CmRV全长基因组cDNA片段，连入p1301-V的构巢曲霉的trpC启动子下游的多克隆位点，得到了全长cDNA的正向表达转化载体pCmRV-cDNA（+）和反向表达转化载体pCmRV-cDNA（-）；将构建好的载体通过热击转化导入农杆菌EHA105菌株，通过农杆菌介导转化技术（ATMT）成功转化盾壳霉ZS-1菌株。对转化子的PCR检测分析表明病毒基因组已经整合到盾壳霉ZS-1的染色体上，RT-PCR检测表明病毒的基因在转化子细胞内正常转录，但是在转化子和正、反向转化子的菌丝融合子代中都没有检测到CmRV核酸的存在。对正、反向转化子的生物学特性分析表明，转化子的表型在菌落形态、产孢能力和对菌核的寄生致腐能力上都没有显著变化（个别除外），确认了CmRV对寄主不存在显著的影响。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 真菌病毒
• 1.1 真菌病毒的发现
• 1.2 真菌病毒的分类
• 1.3 真菌病毒的传播
• 1.4 真菌病毒与寄主的互作
• 1.5 真菌病毒的起源与进化
• 2 盾壳霉与盾壳霉RNA病毒（CmRV）
• 2.1 盾壳霉的研究进展
• 2.1.1 盾壳霉的生物学特性
• 2.1.2 盾壳霉的生态学特性
• 2.1.3 盾壳霉对核盘菌的生物防治
• 2.2 盾壳霉RNA病毒（CmRV）的分子生物学特性
• 3 真菌病毒的反向遗传学研究
• 4 研究目的与意义
• 4.1 本研究的目的
• 4.2 本研究的意义
• 第二章 真菌病毒CmRV全长cDNA表达载体的构建及对盾壳霉ZS-1菌株的转化
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 盾壳霉菌株
• 1.1.2 细菌菌株
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 载体及DNA分子量标记
• 1.1.5 试剂和培养基
• 1.1.6 酶、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养与dsRNA的提取
• 1.2.2 CmRV核酸dsRNA的分离和纯化
• 1.2.3 盾壳霉病毒（CmRV）基因组全长cDNA的克隆
• 1.2.4 利用大肠杆菌转化连接产物
• 1.2.5 CmRV全长cDNA转化载体的构建
• 1.2.6 含重组质粒的农杆菌的制备与培养1.2.6.1农杆菌感受态的制备和热激转化
• 1.2.7 农杆菌介导转化盾壳霉
• 2 结果与分析
• 2.1 dsRNA的提取和纯化
• 2.2 CmRV基因组序列的确认
• 2.3 CmRV全长cDNA序列的克隆
• 2.3.1 全长cDNA亚克隆的构建
• 2.3.2 病毒基因组全长cDNA的获得
• 2.3.3 CmRV全长cDNA转化载体的构建
• 2.4 农杆菌介导转化盾壳霉ZS-1
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 CmRV全长cDNA转化子生物学特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂、培养基和分子标记
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 酶、试剂盒
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化子的PCR鉴定
• 1.2.2 转化子中病毒基因表达的RT-PCR检测
• 1.2.3 转化子dsRNA的电泳检测
• 1.2.4 转化子生物学特性的研究
• 2 结果与分析
• 2.1 转化子的PCR验证
• 2.2 转化子中病毒基因表达的RT-PCR检测
• 2.2.1 转化子总RNA的提取
• 2.2.2 病毒基因表达的RT-PCR检测
• 2.3 转化子的dsRNA检测
• 2.4 转化子生物学特性的研究
• 2.4.1 转化子生长速度的比较分析
• 2.4.2 转化子产孢能力的比较分析
• 2.4.3 转化子寄生致腐菌核能力的测定结果
• 3 结论与讨论
• 研究展望
• 参考文献
• 致谢