牛12个基因的分离、定位、表达特征、SNPs检测及其与部分性状的关联分析

论文摘要

就目前来看，我国动物营养学方面的研究工作基本尚处于机体水平：即在机体水平上研究各种营养素对机体的作用，在机体内的代谢与平衡，影响机体吸收营养素的因素等问题。分子水平方面的研究还刚刚起步，尚处于初级阶段。动物机体的生理病理变化，如生长发育、新陈代谢、遗传变异、免疫与疾病等就本质而言，多数是动物基因表达调控发生了改变的结果，许多生理现象的彻底阐明，最终需要在基因水平上进行解释。所以动物营养学的各方面研究应与分子生物学技术，尤其是与基因工程相结合，从分子水平上解释各种营养素对机体的作用机制，动物机体的生理病理变化等问题。 牛的消化功能由于其生理特征的特异性，而表现为消化的复杂性，一方面由于瘤胃内环境的复杂性，使得营养物质的转化和吸收不能因饲料中营养素含量的多少来决定牛体利用的多少；另一方面是代谢功能的复杂性，这给反刍动物营养工作者提出了严峻的任务。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法，克隆和定位了10个基因，获取了12个基因的相关信息，取得了如下结果： 1．以人的同源基因的cDNA为探针，从GenBank中搜索牛的同源EST，由EST构成的连接群（contig）设计引物，从三河牛基因组中分离克隆了12个基因的部分片段。这12个基因分别为：胆囊收缩素基因（CCK）、谷氨酸脱羧酶基因（GAD1）、谷氨酸脱羧酶基因（GAD2）、甘丙肽基因（GAL）、肠抑胃肽基因（GIP）、果糖二磷酸酶基因（FBP1）、磷酸酯酶基因（PSPH）、羧基肽酶基因（CPB1）、蛋白酶体激活因子PA700相关基因PSMC1、PSMC2、PSMC4和PSMD1基因，并将这些基因的部分序列提交给了GenBank，获得了收录号（DQ111991、DQ111992、DQ111993、DQ111994、DQ111995、DQ118401、DQ118402、DQ120511、DQ120512、DQ120513、DQ139315、DQ139316、DQ139317、DQ146944、DQ160296和DQ166528）。 2．采用电脑克隆策略、RT-PCR和RACE技术，获得了CCK、CPB1、FBP1、GIP基因的全长cDNA序列，并推导出了相应的氨基酸序列。并对序列的特征进行了分析。 3．利用TaqMam PCR技术分析了FBP1、PSPH和PSMC1基因在成年西门塔尔牛的肾脏、心脏、肺脏、脾脏、肝脏、肌肉、睾丸、瘤胃、小肠、淋巴、胸腺等11种组织中的表达情况。结果分析发现：FBP1基因在所检测的11种组织中均有表达，在睾丸组织中的表达量高；而PSPH和PSMC1基因在所检测的10种组织中均有表达，但PSPH基因在淋巴组织中表达量高，PSMC1基因在在肺脏中表达量高，这三

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.文献综述
• 1.1 牛的基因组计划和主要的三种基因图
• 1.2 表达序列标签（EST）在基因克隆中的应用
• 1.3 牛QTL定位研究现状
• 1.4 候选基因分析法克隆基因
• 1.5 牛的与肉质、采食和生长性状相关的候选基因
• 1.6 基因定位技术用于牛的研究现状
• 1.7 辐射杂种板（RH）用于牛染色体定位的研究现状
• 1.8 待分离基因的研究现状
• 1.8.1 胆囊收缩素促胰酶素（Cholcystokinin CCK）
• 1.8.2 谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase GAD）
• 1.8.3 肠抑胃肽（Gastric inhibitory polypeptide GIP）
• 1.8.4 甘丙肽（Galanin GAL）
• 1.8.5 果糖二磷酸酶（Fructose-1,6-bisphosphatase FBP1）
• 1.8.6 磷酸酯酶（Phosphatase PSPH）
• 1.8.7 羧基肽酶（Carboxypeptidase CPB1）
• 1.8.8 PSMC1、PSMC2、PSMC4和PSMD1基因的研究及相关研究进展
• 2.本研究的目的意义
• 3.材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 DNA样品
• 3.1.2 组织样品
• 3.1.3 培养基、酶及试剂盒
• 3.1.4 菌株
• 3.1.5 主要试剂及配制
• 3.1.5.1 主要试剂
• 3.1.5.2 其它试剂的配制
• 3.1.6 主要仪器设备
• 3.1.7 主要分子生物学数据库及软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 用于基因分离的引物的设计方法及引物序列
• 3.2.2 PCR扩增条件
• 3.2.3 产物的纯化、克隆,鉴定和测序
• 3.2.4 DNA序列同源性检索鉴定
• 3.2.5 候选基因cDNA全长序列的克隆方法
• 3.2.6 总RNA提取
• 3.2.7 RNA的甲醛凝胶电泳
• 3.2.8 RACE技术
• 3.2.9 RACE、RT-PCR产物的纯化、克隆,鉴定和测序
• 3.2.10 DNA序列同源性检索鉴定
• 3.2.11 基因的组织表达研究
• 3.2.12 分离基因物理定位的RH法
• 3.2.12.1 引物设计
• 3.2.12.2 PCR扩增分型方法
• 3.2.13 数据分析方法
• 3.2.14 基因的多态性检测方法
• 3.2.15 标记-性状关联分析
• 3.2.15.1 试验牛群
• 3.2.15.2 统计模型和软件
• 4.结果
• 4.1 利用辐射杂种板（RH）进行精细定位结果
• 4.2 牛FBP1、CCK、CPB1和GIP基因的分离、鉴定及相关研究
• 4.2.1 总RNA的提取与检测结果
• 4.2.2 FBP1基因的RACE结果、cDNA序列分析和蛋白质的系统发生树
• 4.2.3 CCK基因的RACE结果及cDNA序列分析
• 4.2.4 CPB1基因的RACE结果及cDNA序列分析
• 4.2.5 GIP基因的RACE结果及cDNA序列分析
• 4.3 新分离的基因多态性检测结果
• 4.3.1 GAD1基因的多态性检测
• 4.3.2 GAD2基因的多态性检测
• 4.3.3 GIP基因的多态性检测
• 4.3.4 GAL基因的多态性检测
• 4.3.5 FBP1基因的多态性检测
• 4.3.6 PSMC1基因的多态性检测
• 4.4 不同基因多态性与性状的关联分析结果
• 4.4.1 GAD1基因SNP与部分性状的关联分析
• 4.4.2 GAL基因102位点SNP与部分性状的关联分析
• 4.4.3 GAL基因837位点SNP与部分性状的关联分析
• 4.4.4 GAD2基因Hae Ⅲ酶切多态与部分性状的关联分析
• 4.4.5 GIP基因SNP与部分性状的关联分析
• 4.4.6 FBP1基因SNP与部分性状的关联分析
• 4.4.7 PSMC1基因SNP与部分性状的关联分析
• 4.5 Real-time定量PCR
• 4.5.1 FBP1基因表达特征
• 4.5.2 PSPH基因的表达特征
• 4.5.3 PSMC1基因的表达特征
• 5.讨论
• 5.1 关于基因的分离
• 5.2 关于基因的定位
• 5.3 关于SNP检测
• 5.4 关于总RNA质量和RACE方法
• 5.5 关于cDNA的分离和推导分析
• 5.6 关于基因多态性与性状的关联分析
• 5.6.1 GAD1和GAD2基因与性状的关联分析
• 5.6.2 基因与采食量、日增重等生产性状的关联分析
• 5.6.3 基因与背膘厚、眼肌面积等胴体性状的关联分析
• 5.6.4 基因与料肉比、净肉率、屠宰率等性状的关联分析
• 5.6.5 基因与胴体长、胴体胸深等胴体性状的关系
• 5.6.6 基因与胃、肠等消化器官发育有关性状的关联分析
• 5.7 关于荧光定量和RT-PCR分析基因在组织中的表达情况
• 6.小结
• 参考文献
• 附录1 FBP1、CCK、GIP和CPB1基因的cDNA全长序列以及推导的氨基酸序列
• 附录2 缩略词表
• 附录3 主要性状的中英文对照和缩写
• 在读期间已发表（待发表）论文和出版的著作
• 致谢