论文摘要
研究背景:沙眼衣原体（Chlamvdia trachomatis,Ct）泌尿生殖道感染是当今世界上最常见的性传播疾病（STD）,每年全球有近9亿的新发病例。Ct的持续感染可以导致女性慢性盆腔炎、不孕症和异位妊娠等严重并发症,同时也提高HIV和HPV传播的几率。虽然抗生素可用于治疗衣原体的生殖道感染,由于无症状Ct感染的普遍存在给预防Ct感染和并发症带来很大困难,因此研制安全有效的疫苗是控制Ct泌尿生殖道感染的最好方法。目前Ct疫苗研究主要以Ct蛋白抗原为基础,Ct主要外膜蛋白（Major outermembrane protein,MOMP）是引起宿主免疫反应的主要靶抗原,多数疫苗的研究以MOMP为研究对象,包括亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗等,目前,这些疫苗研究均处在动物实验阶段,且免疫保护效果差异较大。在人型Ct的19个血清型中,E型为国内外最流行的血清型,占全部Ct感染的40%。与鼠型沙眼衣原体相比,人E型Ct对小鼠的毒力较弱、小鼠感染模型的建立比较困难,因而目前有关E型Ct的疫苗研究较少。为探索新型的沙眼衣原体疫苗,我们以E型沙眼衣原体为研究对象,进行了以下研究:研究目的:1.获得高活性高滴度的E型Ct;建立BALB/c小鼠的E型Ct生殖道感染模型;筛选最佳感染剂量进行疫苗评价。2.评价MOMP重组腺病毒转染DC疫苗的免疫保护作用,为预防E型Ct感染提供实验依据。3.探讨Ct感染后对DC功能的影响,为Ct致病机制的研究提供新思路。研究内容:1.E型Ct的培养扩增及小鼠生殖道感染模型的建立改进E型Ct的培养方法,并对Ct扩增及超声破碎细胞的最佳条件进行了摸索。利用细胞培养时高营养,Ct培养低营养,超声时保持低温的原则,按改进方法进行培养,可在175cm2的细胞培养瓶中扩增得到108IFU的E型Ct,为此后的实验工作奠定了基础。以不同剂量（104、105、106、107IFU）的E型Ct阴道内感染小鼠,感染后不同时间检测小鼠阴道排菌量及生殖道组织病理改变,探讨建立生殖道感染模型的合适感染剂量。实验结果表明:经阴道接种105-107IFU E型衣原体均能造成小鼠生殖道上行性感染（感染率达100%）,而104IFU的感染率在60%左右。生殖道主要的病理改变包括:生殖道粘膜层水肿;粘膜层上皮细胞灶性坏死,糜烂;粘膜及粘膜下层中性粒细胞浸润;血管扩张充血。以上结果表明:我们成功建立了小鼠E型Ct生殖道感染模型,106-7IFU接种能造成小鼠严重的感染,105 IFU是使小鼠感染致病的最小感染剂量。2、E型Ct MOMP重组腺病毒转染树突状细胞的免疫保护作用选用Ad-MOMP转染DC疫苗免疫小鼠来评价该疫苗的体内免疫保护效果。我们主要做了以下内容:1)DC诱导培养及重组Ad-MOMP的转染常规方法诱导培养小鼠骨髓来源的DC,流式细胞术检测可知,诱导培养6d、LPS刺激2d时CD11c阳性的DC能够达到66%,MHC-Ⅱ阳性的DC达81.54%,双标的细胞占50%,说明成功诱导培养出DC。LPS刺激48h后,收集DC,以不同滴度的Ad-EGFP转染DC,转染后48h倒置荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数。发现当MOI为1000时,90%以上的DC表达绿色荧光蛋白,故选用MOI=1000为最佳感染滴度,进行重组Ad-MOMP的转染。2)小鼠的免疫接种选用6～8周龄BALB/c雌性小鼠,实验分组:Ad-MOMP转染DC组（Ad-MOMP-DC组）、对照空腺病毒Ad转染DC组（Ad-DC组）、死EB冲击DC组（死EB-DC组）、未转染DC组（DC组）。每只小鼠尾静脉注射1×106细胞/100μl,间隔两周重复免疫一次。3)E型Ct攻击前小鼠免疫效果的测定末次免疫后两周,孕酮处理后一周,小鼠尾静脉采血,ELISA方法检测血清中Ct特异型抗体（IgG、SIgA、IgG2a/IgG1）及阴道SIgA;无菌制备小鼠脾细胞培养上清,ELISA检测细胞因子（IFN-γ/和IL-10）。实验结果表明,与Ad-DC组相比,Ad-MOMP-DC组的特异性抗体（IgG、sIgA、IgG2a）水平明显升高,阴道冲洗液中能够检测到少量的sIgA;与死EB-DC组相比,Ad-MOMP-DC组特异性抗体（IgG、sIgA、IgG2a）的水平与之相当。提示Ad-MOMP-DC免疫能够诱导小鼠产生体液免疫反应和生殖道局部粘膜免疫反应。Ad-MOMP-DC组的IgG2a水平明显升高（P＜0.05）,脾细胞培养上清中可检测到高水平IFN-γ,提示免疫鼠体内建立了Th1型免疫应答。4)E型Ct攻击后小鼠免疫效果的测定末次免疫后两周,孕酮处理一周,小鼠阴道内注射105IFU/10μl的E型沙眼衣原体。观察衣原体攻击后小鼠的一般状态、体重变化、阴道排菌量、生殖道Ct的定植以及小鼠生殖道的病理改变。结果发现:攻击后的小鼠,精神状态普遍不佳,进食和活动量都有减少;与Ad-DC组相比,Ad-MOMP-DC免疫组小鼠的体重下降较慢,恢复较快;阴道排菌量和生殖道Ct定植量检测发现,Ad-MOMP-DC组阴道排菌量和定植量要显著低于Ad-DC组（P＜0.05）;攻击后10d的生殖道组织病理切片观察发现,未免疫组、DC组及Ad-DC组小鼠的输卵管有弥漫炎细胞浸润;与之相比,Ad-MOMP-DC组和死EB-DC组小鼠的输卵管炎症不明显,仅有少数炎细胞浸润。综合分析说明,Ad-MOMP-DC疫苗免疫对E型Ct生殖道攻击具有良好的免疫保护作用。各组小鼠的卵巢基本正常无明显炎症,说明E型Ct的感染比较缓慢,感染10天时还没有上行至卵巢。3.鼠型沙眼衣原体感染DC后有利于DC向DC1方向分化为探讨Ct感染对DC功能的影响,我们做了两部分实验:1)选用鼠型沙眼衣原体（Chlamydia muridarum,C.muridarum）感染小鼠骨髓来源的DC,不同的时间进行包涵体的染色,发现C.muridarum在DC中可以存活并缓慢生长;与Hep-2细胞中形成的包涵体相比,在镜下观察DC内没有感染性的原体,其衣原体处于非感染状态。2)对感染后DC分泌细胞因子及促进T细胞增殖的功能进行了检测,发现感染后DC能够分泌较高水平的IL-12;并能促进同种异体T细胞增殖和分泌较高水平的IFN-γ,说明其抗原递呈功能没有受到明显的影响,C.muridarum感染可诱导DC向DC1分化。研究结论:1.成功培养出高活性高滴度的E型Ct;建立了E型Ct小鼠生殖道感染模型;筛选出疫苗评价时所用最佳的感染剂量为105IFU。2.Ad-MOMP-DC疫苗免疫可诱导小鼠产生以Th1为主的免疫反应,对E型Ct生殖道攻击具有良好的免疫保护作用。3.成功建立沙眼衣原体感染DC的体外细胞模型,初步的功能分析发现沙眼衣原体感染可诱导DC向DC1分化。