论文摘要
研究目的:视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina,神经视网膜）组成,RPE细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合,共同组成一个统一的功能单位,对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外,视网膜存在着内、外屏障,视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成,而RPE细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障,防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障,神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍,血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内,引起视网膜水肿或脱离。视网膜移植研究表明,若在神经视网膜未发生退化变性前移植RPE细胞或共同移植RPE细胞层和感光细胞层,RPE细胞往往会分化良好,若感觉层已发生变性,单纯移植RPE细胞会使移植体发生去分化,而失去RPE细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导RPE的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在RPE细胞层对神经视网膜的影响,而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手,利用基因学手段检测了RPE细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的RPE细胞功能,尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节RPE发育的关键因素,为将来视网膜疾病的治疗,尤其是RPE移植提供理论基础。研究方法:本研究利用Affymetrix基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7,E10,E14,E18）RPE的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的E7,E14 RPE细胞的基因表达的调节,利用STEM（Short Time-serfes Expression Minet）软件根据基因在不同发育时期,或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（clusteranalysis）,并在此基础上利用Gene Ontology分类软件和Affymetrix软件进行功能分类,根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与RPE屏障功能密切相关的基因,如claudin家族及ZO家族,我们又利用实时定量PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在mRNA水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个claudin的功能进行研究,目前已以claudin 20为目标做了先锋实验,通过siRNA抑制其表达观察对培养的RPE细胞屏障功能的影响。结果:在Affymetrix基因芯片上的37694个探针组（probe sets）中,RPE组织中检测到20495个基因表达,其中8889个基因的表达在发育过程中受到调节,4814个基因的表达变化具有显著性意义,并根据表达模式分为12类,每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与22个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量PCR结果对比,仅有2个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示,体内所表达基因的89%和86%分别在E7和E14中表达,均包括RPE标志性基因如RPE65和Bestrophin。其中,在E7细胞中,15%的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节,E14细胞中,仅约1.9%受到调节。通过对其中610个与RPE功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现,在培养的E7和E14细胞中,分别有17%和6.2%的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于RPE屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白claudin家族成员的调节。除对该家族蛋白在mRNA水平的调节外,Western Blot和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins在蛋白水平还存在着不同的调节机制。结论:基因芯片技术为我们所提供的对于RPE细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价RPE细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎RPE细胞的基因表达与正常组织相似,尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后,细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的RPE细胞（E7）,神经视网膜分泌物可以促进其分化;而对于已成熟的RPE细胞（E14）,则主要表现为维持其生物学特性。通过对TJ蛋白claudin家族在mRNA及蛋白水平的研究发现,rcSF3可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平,且对于同一个claudin在mRNA和蛋白水平可能存在不同的调节机制。
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- [5].神经生长因子对糖尿病大鼠神经视网膜超微结构的影响[J]. 国际眼科杂志 2008(06)
- [6].早期糖尿病视网膜病变中eEF2K活性变化的实验观察[J]. 临床眼科杂志 2019(01)
- [7].老年性黄斑变性的中医研究近况[J]. 中国医疗前沿 2008(16)
- [8].年龄相关性黄斑变性与C反应蛋白的相关性分析[J]. 中国眼耳鼻喉科杂志 2012(06)
- [9].视网膜色素上皮发育发生学的研究进展[J]. 国际眼科杂志 2014(03)
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