L-鸟氨酸产生菌的原生质体融合育种及发酵条件研究

论文摘要

本文以代谢调控发酵理论为指导,重点研究了L-鸟氨酸高产菌的选育及其发酵条件。（1）以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经紫外线与氯化锂复合诱变、以及氟乙酸、谷氨酰胺复合抗性平板初筛,选育出一株谷氨酸高产菌HG-G7,该菌株可积累谷氨酸63.29g/L,比出发菌株产酸提高了102.4%;（2）确定了谷氨酸棒杆菌HG-G7与谷氨酸棒杆菌HG106-17原生质体制备的最佳条件,以液体完全培养基将谷氨酸棒杆菌HG-G7和HG106-17预培养至对数生长期,然后分别对HG-G7用0.4U/mL青霉素钠预处理2h,对HG106-17用0.9U/mL青霉素钠预处理2.5h后,再分别对HG-G7用1.0mg/mL蛋清溶菌酶处理12h,对HG106-17用1.4mg/mL蛋清溶菌酶处理14h,处理温度均为34℃,此时原生质体制备率均达到98%左右;（3）确定了谷氨酸棒杆菌HG-G7与谷氨酸棒杆菌HG106-17原生质体融合的最佳条件,以35%PEG处理上述制备的两原生质体,处理时间为35min,最佳处理温度选择36℃,原生质体融合率达2.6×10-5;（4）上述融合子经高渗选择培养基筛选,定向选育出了具有目的遗传标记的39株融合子,经过对这些融合子进行初筛和复筛,得到13株在摇瓶发酵条件下,L-鸟氨酸产量高于HG106-17产L-鸟氨酸的量,选择其中产量最高的一株,L-鸟氨酸积累量达到19.31g/L的目的融合子RH169。将目的融合子RH169连续传代,结果表明该融合子的遗传性状是稳定的;（5）对选育获得的L-鸟氨酸高产菌进行摇瓶分批发酵试验,运用单因素实验及正交设计实验法优化出最佳发酵培养基组成为（g/L）:葡萄糖70、硫酸铵80、玉米浆35、酵母膏25、MgSO4·7H20 0.4、K2HPO4 0.5、KH2PO4 0.5、FeSO4·7H20 0.2、MnSO4·H20 0.2、L-精氨酸0.5、CaCO3 20,生物素20μg/L,VB1 20μg/ L;（6）通过研究不同发酵条件对L-鸟氨酸发酵的影响,初步获得了最佳摇瓶分批发酵的培养条件:发酵培养基初始pH为7.07.2之间;发酵温度为30℃;装液量为35mL/500mL三角瓶;摇瓶转速为220r/min;发酵周期为72h。在最优条件下,目的融合子RH169摇瓶分批发酵L-鸟氨酸产量达到22.36g/L,比初始条件下（19.62 g/L）提高了13.96%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 L-鸟氨酸的研究背景
• 1.1.1 L-鸟氨酸的结构与性质
• 1.1.2 L-鸟氨酸的应用
• 1.1.2.1 在医疗领域的应用
• 1.1.2.2 在保健行业的应用
• 1.1.2.3 在化工领域的应用
• 1.2 L-鸟氨酸育种策略的研究概况
• 1.2.1 产L-鸟氨酸的菌株
• 1.2.2 L-鸟氨酸的生物合成途径
• 1.2.3 L-鸟氨酸高产菌株的育种策略
• 1.3 原生质体融合育种的研究概况
• 1.3.1 原生质体融合技术
• 1.3.2 原生质体融合技术的特点
• 1.3.2.1 可进行属间杂交
• 1.3.2.2 基因重组率高
• 1.3.2.3 与其他育种方法结合使用实现定向选育的目的
• 1.3.3 原生质体形成与再生需考虑的因素
• 1.3.3.1 菌龄和培养条件对原生质体形成的影响
• 1.3.3.2 酶种类与酶浓度对原生质体形成的影响
• 1.3.3.3 酶解时间与酶解温度对原生质体形成的影响
• 1.3.4 融合过程需考虑的因素
• 1.3.4.1 PEG 融合剂
• 2+的影响'>1.3.4.2 Ca²⁺的影响
• 1.3.5 不同融合子的检出方式
• 1.3.5.1 利用营养缺陷性筛选融合子
• 1.3.5.2 利用抗性标记选择融合子
• 1.3.5.3 利用分子标记选择融合子
• 1.3.6 原生质体融合选育氨基酸产生菌的实例
• 1.4 L-鸟氨酸发酵条件的研究概况
• 1.4.1 培养基组成成分对产酸的影响
• 1.4.2 培养条件对产酸的影响
• 1.5 本课题的研究宗旨与目标
• 第2章 抗性标记菌株的制备
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 9114菌体生长曲线的绘制'>2.3.1 谷氨酸棒杆菌S₉₁₁₄菌体生长曲线的绘制
• 2.3.2 紫外线诱变致死曲线的绘制
• 2.3.3 氯化锂诱变致死曲线的绘制
• 2.3.4 抗性突变株的筛选
• 2.3.5 抗性标记菌株的稳定性试验
• 2.4 结论
• 第3章 原生质体融合选育L-鸟氨酸高产菌株
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 结论
• 第4章 L-鸟氨酸高产菌摇瓶发酵条件的优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 发酵培养基的优化
• 4.3.2 发酵培养条件的优化
• 4.4 结论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 全文总结
• 9114诱变选育谷氨酸高产菌'>5.1.1 由谷氨酸棒杆菌S₉₁₁₄诱变选育谷氨酸高产菌
• 5.1.2 原生质体融合选育L-鸟氨酸高产菌
• 5.1.3 L-鸟氨酸高产菌摇瓶发酵条件的优化
• 5.2 本论文创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表论文情况