南海海域苏云金芽孢杆菌的分离筛选和产几丁质酶条件初探及一株几丁质降解菌的鉴定

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,它产生的杀虫晶体蛋白是巨大的天然害虫生防资源,对多个目的害虫具有杀虫活性;而几丁质酶（chitinase）作为一种重要的杀虫活性物质,具有多种富有价值的生物学功能,它们在生物防治、环境保护等方面都具有重要的社会效益和经济价值。因此,开展新型苏云金芽孢杆菌资源的分离筛选、鉴定、分子生物学以及产几丁质酶相关条件的研究都具有重要意义。海洋环境的特殊性往往造就了海洋微生物及其代谢产物的多样性,因而是人们寻找与发现活性物质产生菌的重要场所。本研究采用醋酸钠法加热处理,对南海吕宋、越南上升流区所采集的水体和沉积物样品进行了分离筛选,共得到22株苏云金芽孢杆菌菌株,在扫描电镜下观察,发现除两株伴孢晶体形状为菱形外,其余的均为球形晶体。通过透明光圈法,在以胶体几丁质为唯一碳源的无机盐培养基上,筛选出一株产几丁质酶活性较高的菌株B-19,并对其产酶特性及温度、碳源、氮源等、pH值等产酶条件的优化进行了初步研究。经过一系列的研究,苏云金芽孢杆菌B-19确定了较适宜的产酶条件:培养基中添加1%酵母粉,2%胶体几丁质,初始pH为7.0,培养温度为30℃,最佳培养时间为36h,摇床转速160r/min。Mg2+、Ca2+、Li+和Ni2+等金属离子对几丁质粗酶液有明显的激活作用,而K+、Zn+等离子对酶活有抑制作用。在此优化条件下,苏云金芽孢杆菌B-19发酵液的几丁质酶活力提高了大约200%。几丁质酶是一种诱导酶,几丁质是它的诱导物,而几丁单糖（N-乙酰氨基葡萄糖,NAG）和葡萄糖（glucose）阻遏几丁质酶的产生。这些研究的初步结果为以后海洋环境中苏云金芽孢杆菌的分离筛选、鉴定和产几丁质酶的研究和利用奠定了基础。此外,我们还从沉积物样品中筛选出一株几丁质降解菌B-Y20,经生理生化试验及16S rDNA分子鉴定,确定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,为人们今后对海洋微生物特别是深海环境中几丁质降解菌的开发和利用提供新的菌种资源基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 海洋微生物活性物质研究概况
• 1.1.1 海洋微生物的定义
• 1.1.2 海洋微生物活性物质的研发现状
• 1.1.3 海洋微生物杀虫活性物质的研究进展
• 1.2 微生物农药研究概况
• 1.2.1 微生物农药的研究现状
• 1.2.2 微生物杀虫剂研究进展
• 1.2.3 海洋生物农药研发现状
• 1.3 苏云金芽孢杆菌的研究概况
• 1.3.1 苏云金芽孢杆菌简介
• 1.3.2 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及分布
• 1.3.3 苏云金芽孢杆菌的分离方法
• 1.3.4 苏云金芽孢杆菌的分类及鉴定
• 1.4 微生物几丁质酶研究概况
• 1.4.1 几丁质和几丁质酶
• 1.4.2 微生物几丁质酶的性质
• 1.4.3 微生物几丁质酶的作用
• 1.4.4 苏云金芽孢杆菌产几丁质酶特性
• 1.4.5 几丁质酶对苏云金芽孢杆菌的杀虫增效作用
• 1.5 中国南海微生物资源开发利用的重要性
• 1.6 本论文的研究思路、目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 研究海区
• 2.1.2 样品采集
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要软件
• 2.1.6 主要试剂
• 2.1.7 主要仪器
• 2.1.8 培养基
• 2.1.9 溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 Bt菌株的分离筛选
• 2.2.2 芽孢染色
• 2.2.3 电镜观察
• 2.2.4 生理生化试验
• 2.2.5 几丁质降解菌的16SrDNA鉴定
• 2.2.6 产几丁质酶Bt菌株筛选
• 2.2.7 产酶菌株B-19生长曲线测定
• 2.2.8 几丁质酶合成的培养条件
• 2.2.9 几丁质酶活力的测定
• 2.2.10 产酶菌株B-19的产酶曲线
• 2.2.11 产酶条件的初步研究
• 2.2.11.1 不同碳源对菌株B-19产酶的影响
• 2.2.11.2 不同氮源对菌株B-19产酶的影响
• 2.2.11.3 培养基初始pH对菌株B-19产酶的影响
• 2.2.11.4 不同温度对菌株B-19产酶的影响
• 2.2.11.5 不同几丁质浓度和形式对菌株B-19产酶的影响
• 2.2.11.6 不同金属离子对几丁质酶活的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 Bt菌的筛选分离结果
• 3.2 菌体形态特征
• 3.3 沉积物中几丁质降解菌的筛选
• 3.4 沉积物中几丁质降解菌株的鉴定
• 3.5 产几丁质酶Bt菌的筛选
• 3.6 菌株B-19生长曲线
• 3.7 菌株B-19耐盐性试验
• 3.8 菌株B-19产酶曲线
• 3.9 菌株B-19产酶条件初步研究
• 3.9.1 不同碳源对菌株B-19产酶的影响
• 3.9.2 不同氮源对菌株B-19产酶的影响
• 3.9.3 培养基初始pH对菌株B-19产酶的影响
• 3.9.4 不同培养温度对菌株B-19产酶的影响
• 3.9.5 不同几丁质浓度和形式对菌株B-19产酶的影响
• 3.9.6 不同金属离子对几丁质酶活的影响
• 4 讨论
• 4.1 苏云金芽孢杆菌的分离筛选
• 4.2 几丁质酶产生菌的筛选
• 4.3 几丁质酶活力的测定
• 4.4 产几丁质酶的发酵条件优化
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻硕期间参加的科研课题和发表、待发表论文情况
• 致谢