猪MIF基因克隆及表达调控研究

论文摘要

巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）是发现能抑制巨噬细胞随机迁移的关键细胞因子,在炎症反应中发挥重要作用。本文通过同源序列法,设计扩增基因的特异性引物,利用RT-PCR技术克隆了梅山猪MIF基因全编码序列及基因组序列;用辐射杂种细胞学技术（RH）对基因进行染色体定位;采用生物信息学和分子生物学技术分析其核苷酸和氨基酸序列;用实时定量PCR方法分析MIF基因的组织表达谱;构建基因的真核表达载体并实现了离体细胞超表达。根据HTGS数据库信息,克隆到猪MIF基因5′侧翼长2000bp的启动子序列,并用双荧光素酶报告基因系统检测猪MIF启动子活性。通过不同浓度的罗格列酮(10-5,5×10-5,10-6mol/L)刺激或将pcDNA-PPARγ2载体转染NIH3T3成纤维细胞,分析PPARγ2对MIF基因表达调控的影响。结果表明:（1）克隆得到梅山猪MIF基因全长编码区348 bp,编码115个氨基酸,克隆到两个内含子、三个外显子和3′非翻译区共761 bp的基因组片段;（2）猪MIF基因定位在第14号长臂21区;（3）MIF基因在组织中广泛表达,胃中表达量最高,脾脏其次,肌肉和心脏中表达量最低;（4）成功的构建pIRES2-MIF真核表达载体,并在NIH3T3成纤维细胞系中实现超表达;（5）克隆扩增到MIF基因启动子序列,构建启动子活性荧光素酶检测载体,证实该片段有启动子活性;（6）在NIH3T3细胞中,PPARγ2能够上调MIF基因的转录。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.2 MIF的功能研究
• 1.2.1 MIF基因的结构
• 1.2.2 MIF蛋白质的结构
• 1.2.3 MIF的组织来源
• 1.3 MIF的表达调控
• 1.3.1 MIF与受体作用
• 1.3.2 MIF与MCP-1的关系
• 1.3.3 MIF与JAB-1/Ap-1途径
• 1.3.4 MIF对p53的调节
• 1.3.5 MIF对糖皮质激素作用的调节
• 1.4 与疾病的关系
• 1.4.1 MIF与炎症反应
• 1.4.2 MIF与肥胖综合征
• 1.4.3 MIF与肿瘤
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 RNA样品
• 2.1.3 DNA样品
• 2.1.3.1 用于组织分布和基因片段分离cDNA样品
• 2.1.3.2 用于基因片段分离的模板基因组DNA样品
• 2.1.3.3 用于基因染色体定位的DNA样品
• 2.1.4 载体及菌株
• 2.1.5 工具酶、试剂盒和生化试剂
• 2.1.6 主要培养基和溶液的配制
• 2.1.6.1 细菌培养基的配制
• 2.1.6.2 细胞培养基的配制
• 2.1.6.3 缓冲液配制
• 2.1.6.4 质粒抽提相关溶液配制
• 2.1.6.5 制备感受态细胞所用试剂
• 2.1.6.6 罗格列酮的配制
• 2.1.7 主要仪器设备
• 2.1.8 主要分子生物学软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA的提取、纯化处理及鉴定
• 2.2.1.1 组织总RNA的提取（参照Invitrogon Trizol说明书）
• 2.2.1.2 细胞总RNA的提取（参照Shanghai Sangon Trizol说明书）
• 2.2.1.3 组织总RNA的纯化处理（参照DNase I说明书）
• 2.2.1.4 总RNA纯度鉴定及含量测定
• 2.2.1.5 cDNA的合成（参照M-MuLV逆转录酶说明书）
• 2.2.1.6 组织总DNA的提取
• 2.2.2 猪MIF基因的克隆
• 2.2.2.1 克隆猪MIF基因cDNA片断
• 2.2.2.2 用3'-Rapid Amplification of cDNA Ends（3'-RACE）方法获取猪MIF基因的全长cDNA
• 2.2.2.3 猪MIF基因内含子序列的扩增
• 2.2.2.4 猪MIF基因启动子的克隆
• 2.2.3 PCR扩增产物的纯化、连接和转化
• 2.2.3.1 用DNA回收试剂盒回收DNA片段
• 2.3.3.2 DNA特异片段连接载体
• 2.2.3.3 感受态细胞制备及转化
• 2.2.4 质粒的检测与测序
• 2.2.4.1 质粒的小量抽提:碱裂解法
• 2.2.4.2 连接质粒的双酶切检测与测序
• 2.2.4.3 DNA序列同源性检索鉴定
• 2.2.5 序列比对与进化分析
• 2.2.6 猪MIF基因的染色体定位
• 2.2.6.1 染色体定位所用引物的设计
• 2.2.6.2 染色体定位所扩增片断大小及PCR反应条件
• 2.2.6.3 PCR扩增条带分型方法
• 2.2.6.4 数据分析方法
• 2.2.7 RealTime-PCR检测猪MIF基因的组织表达谱
• 2.2.7.1 组织表达谱的引物设计
• 2.2.7.2 MIF和GAPDH基因扩增的RealTime-PCR反应条件
• 2.2.7.3 RealTime-PCR结果数据分析
• 2.2.8 细胞培养
• 2.2.9 药物刺激
• 2.2.10 细胞转染
• 2.2.10.1 质粒的大量抽提
• 2.2.10.2 转染
• 2.2.10.3 细胞总RNA的提取
• 2.2.10.4 以β-actin为内参用RealTime-PCR检测MIF的表达量
• 2.2.11 双荧光素酶报告基因检测
• 3 结果与分析
• 3.1 猪MIF基因全长编码区cDNA和基因组DNA的克隆
• 3.2 猪MIF基因基因组DNA结构分析与系统进化树的构建
• 3.2.1 猪MIF基因基因组DNA结构分析
• 3.2.2 系统进化树的构建
• 3.3 MIF基因的染色体定位
• 3.4 MIF基因的组织表达谱
• 3.5 真核表达载体的构建及其融合蛋白的体外表达
• 3.5.1 pIRES2-EPFP载体的构建
• 3.5.2 融合蛋白的体外表达
• 3.6 猪MIF基因启动子区的克隆,PGL3载体的构建及启动子活性的检测
• 3.6.1 猪MIF基因启动子区的克隆
• 3.6.2 猪MIF基因启动子区转录因子结合位点的预测
• 3.6.3 pGL3载体的构建
• 3.6.4 猪MIF启动子活性的检测
• 3.7 PPARr2对MIF的转录调控影响
• 3.7.1 不同浓度的罗格列酮处理对PPARγ2和MIF基因表达的影响
• 3.7.2 在NIH3T3细胞系中超表达pcDNA3.1-PPARγ对MIF基因表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 猪MIF基因的结构特征、氨基酸序列及亲缘关系比较
• 4.2 猪MIF在染色体上定位
• 4.3 猪MIF的组织表达
• 4.4 猪MIF基因启动子
• 4.5 PPARr2对MIF转录调控的影响
• 5 结论与创新
• 参考文献
• 研究生在读期间论文发表情况
• 致谢
• 附录
• 1 MIF基因组序列
• 2 MIF启动子序列