论文摘要
研究目的：探讨miR-33a/b在不同转移潜能人皮肤黑色素瘤细胞系中的表达特点和意义。干预不同人皮肤黑色素瘤细胞系中miR-33a/b表达后,体外实验水平观察细胞的增殖、粘附、运动、凋亡和上皮-间质转化等肿瘤细胞恶性生物学功能的变化。干预黑色素瘤A375细胞中miR-33a表达后,在体实验水平观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。探讨miR-33a/b影响人黑色素瘤细胞恶性生物学功能的可能机制。研究方法：通过real-time PCR法检测miR-33a/b在低转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM35及高转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表达量。明确miR-33a/b在黑色素瘤细胞系中的表达情况,筛选miR-33a/b高表达和低表达的黑色素瘤细胞系作为进一步的实验研究对象。构建pYr-LVX-pri-miR-33a慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后感染A375细胞,建立hsa-miR-33a稳定过表达细胞系A375-pYr-LVX-pir-miR-33a;构建pYr-LVX-miR-33a-sponge慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后分别感染WM35、WM451细胞,建立hsa-miR-33a表达抑制的稳定细胞系WM35-pYr-LVX-miR-33a-sponge和、VM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge o以1niR-33a表达稳定上调／抑制细胞系为研究对象,运用MTT法检测细胞增殖能力；平板克隆形成实验检测细胞克隆数；流式细胞术检测细胞凋亡率；细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭力；、Vestern Blot法检测与EMT相关的E-钙粘连蛋白（E-Cadherin）、N-钙粘连蛋白（N-Cadherin）的表达情况。多层面探讨miR-33a的表达对细胞增殖、细胞凋亡、侵袭转移和EMT等表型的影响。通过皮下接种及尾静脉注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a细胞建立裸鼠种植瘤及移植瘤模型,观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。采用生物信息学分析法预测HIF-1α可能为miR-33a的下游靶因；Western Blot法检测miR-33a表达变化时HIF-1α蛋白的表达水平；应用双荧光素酶基因报告法进一步验证HIF-1α是否为miR-33a的直接靶基因。研究结果：miR-33a与1niR-33b在低转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株WM35中表达量均高,而在高转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株VM451、A375和SK-MEL-1中的表达量相对较低（WM35>WM451>A375> SK-MEL-1）;上调A375细胞株中1niR-33a的表达能抑制细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化；抑制WM451和WM35细胞株中miR-33a的表达能促进细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化；miR-33a对细胞凋亡的影响无统计学差异。miR-33a能抑制种植瘤的形成速度,减少肺脏转移灶的数目。生物信息学预测HIF-1α为miR-33a的下游靶基因。过表达A375中miR-33a的表达后,HIF-1α的表达下降；抑制WM35、WM451中miR-33a的表达后HIF-1α的表达上升。双荧光素酶报告实验进一步证实HIF-1α为miR-33a的直接靶基因。研究结论：miR-33a与miR-33b在低转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤中的表达量高于高转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤。miR-33a能抑制人黑色素瘤细胞株的细胞增殖、侵袭转移,调节上皮-间质转化过程,但不影响细胞凋亡；miR-33a能抑制种植瘤及转移瘤的形成,提示miR-33a为黑色素瘤的抑癌基因。miR-33a可能通过直接靶向调节HIF-1α而影响黑色素瘤细胞的恶性生物学表型。图24幅,参考文献