饲用芽孢杆菌先天抗鲎素筛选及后天抗鲎素选育研究

论文摘要

鲎素(Tachyplesin Ⅰ)是一种从鲎的血液中提取的由17个氨基酸残基组成的阳离子抗菌肽,具有广谱抗细菌、真菌、霉菌、病毒、原虫、抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化等多种生物活性,是一种具有巨大潜在应用价值的肽类抗生素；然而由于鲎素对宿主菌的强烈的抑杀作用使得难于实现其基因工程高效表达,这严重制约了鲎素的研究和应用。本实验通过先天抗鲎素筛选和后天连续耐鲎素诱导选育两种方法来筛选抗鲎素的饲用芽孢杆菌菌株,以期得到抗鲎素的宿主菌,解决鲎素对宿主菌的强烈抑杀这一关键难题。本论文的内容包括以下几个部分：1、采用肉汤微量稀释法测定了鲎素对枯草芽孢杆菌BS168和WB800、环状芽孢杆菌CICC22015、迟缓芽孢杆菌CICC10365、坚强芽孢杆菌CICC23258、纳豆芽孢杆菌CICC20443、短小芽孢杆菌CICC9003、凝结芽孢杆菌AS 1.2009、巨大芽孢杆菌AS1.223、地衣芽孢杆菌AS1.269和蜡状芽孢杆菌AS1.196的抑杀活性；结果鲎素对它们的MIC(最小抑菌浓度)分别为20、20、20、2.5、40、40、20、20、20、20、20ug/ml,MBC(最小杀菌浓度)分别为80、80、80、20、160、160、80、80、80、80、80ug/ml。由于枯草芽孢杆菌自身的优势及其对鲎素的敏感性也较低,我们选择其作为目的菌株来进行后面的实验。2、通过传统的微波诱变方法和采用具有创新意义的连续耐鲎素诱导的方法作用于BS168菌株；结果通过微波诱变得到的菌株虽然可以在含致死鲎素浓度(40ug/ml)的平板上可以生长,但是后面的验证实验表明得到的菌株对鲎素的敏感性比原始菌低,不能用来作为鲎素基因工程表达的宿主；而连续升鲎素浓度诱导的方法得到的诱导菌可以在含150ug/ml鲎素浓度的营养肉汤培养基中连续生长。通过体外药敏试验和高抗药菌株抗药稳定性检测实验验证了该菌株对鲎素具有抵抗能力,对鲎素产生了抗药性。3、通过研究鲎素对原始菌和诱导菌的抑菌动力学,鲎素对原始菌和诱导菌的细胞膜渗透性和用扫描和透射电镜观察经过与鲎素孵育前后细菌超微形态结构的变化。通过比较原始菌和诱导菌之间的区别,结果显示鲎素对原始菌和诱导菌具有不同的抑菌动力学,鲎素对原始菌和诱导菌的细胞膜渗透性也不一样,超微结构形态等也不同,即经过连续升鲎素浓度诱导后得到的诱导菌(抗性菌株)与原始菌之间存在很多的差异。4、比较了原始菌和诱导菌之间的胞外蛋白酶酶活和酶谱之间的差异；应用双向电泳技术分析了原始菌和诱导菌之间的胞外蛋白组学；用Alcain Blue(AB)染色法检测原始菌和诱导菌细胞壁膜上的负电荷数差异。结果显示：原始菌和诱导菌胞外蛋白酶在酶的活性和酶的种类之间均存在差异,同时在细胞壁膜负电荷数之间也存在差异,而且原始菌和诱导菌在胞外蛋白组学也存在差异,而正是这些差异的存在,导致了枯草芽孢杆菌BS168诱导菌对鲎素具有抵抗能力。参考前人的文献,同时结合我们研究造成原始菌和诱导菌之间存在差异的原因,我们研究了细菌对阳离子抗菌肽鲎素产生抗药性的分子机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鲎及鲎素的研究进展
• 1.1.1 鲎的种类及分布
• 1.1.2 鲎源抗菌肽
• 1.1.3 鲎素的抗菌能力
• 1.1.4 鲎素的应用前景
• 1.1.5 鲎素的抗菌机制
• 1.1.6 鲎素的来源
• 1.1.7 鲎素的基因工程表达现状
• 1.2 细菌对菌肽产生抗药性研究进展
• 1.2.1 细菌对抗菌肽抗药性的出现
• 1.2.2 细菌对抗菌肽AMPs抗药性的分类
• 1.2.3 细菌对抗菌肽AMPs的抗药性机制
• 1.3 本论文的立题依据和研究内容
• 第二章 鲎素对几种饲用芽孢杆菌的抑杀作用
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1. 实验材料
• 2.2.2. 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 枯草芽孢杆菌BS168抗药性致死突变标志微波诱变筛选研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 鲎素对枯草芽孢杆菌BS168致死浓度的测定
• 3.3.2 微波诱变剂量的测定
• 3.3.3 微波诱变结果
• 3.3.4 微波诱变前后原始菌和诱变菌MIC的测定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 枯草芽孢杆菌BS168耐鲎素诱导及原始菌和诱导菌生理生化研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1. 实验菌株
• 4.2.2. 鲎素溶液的配制
• 4.2.3. 培养基和试剂的配制
• 4.2.4. 主要的仪器设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 体外耐药性的诱导试验
• 4.3.2 体外药敏试验的测定
• 4.3.3 高抗药菌株抗药稳定性检测
• 4.3.4 鲎素对BS168原始菌和诱导菌QP抑菌动力学的研究
• 4.3.5 鲎素对枯草芽孢杆菌BS168原始菌和诱导菌QP细胞膜渗透性的影响
• 4.3.6 电镜下观察鲎素对细菌诱导前后的形态学及超微结构变化
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 鲎素浓度逐级递增营养肉汤诱导法
• 4.4.2 高抗药菌株（QP）抗药稳定性检测
• 4.4.3 鲎素对BS168原始菌和诱导菌QP抑菌动力学的研究
• 4.4.4 鲎素对枯草芽孢杆菌BS168原始菌和诱导菌QP细胞膜渗透性的影响
• 4.4.5 鲎素诱导前后菌的超微结构的变化
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第五章 诱导菌耐鲎素相关机制分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 实验试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 枯草芽孢杆菌BS168原始菌和不同鲎素浓度诱导菌胞外蛋白酶酶活的测定
• 5.3.2 鲎素长期诱导对菌株细胞壁膜负电荷数影响的测定
• 5.3.3 BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶酶谱检测
• 5.3.4 BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶的双向电泳分析
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 枯草芽孢杆菌BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶酶活的测定
• 5.4.2 鲎素长期诱导对菌株细胞壁膜负电荷数影响的测定
• 5.4.3 BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶酶谱检测
• 5.4.4 BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶的双向电泳分析
• 5.5 讨论
• 5.5.1 枯草芽孢杆菌BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶酶活比较
• 5.5.2 枯草芽孢杆菌BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶酶谱分析
• 5.5.3 鲎素长期诱导对枯草芽孢杆菌细胞壁膜负电荷的影响
• 5.5.4 BS168原始菌和诱导菌胞外蛋白酶的双向电泳凝胶图谱分析
• 5.6 本章小结
• 总结与展望
• 本文总结
• 展望
• 本论文创新之处
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介