日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定

论文摘要

在海洋生物中,七鳃鳗（lampetra japonica）是迄今所知道的最原始的无颌类脊椎动物,不仅是研究脊椎动物起源与进化的关键物种,同时也是研究脊椎动物发育与分化的最佳模式动物之一。此外,日本七鳃鳗唾液腺分泌的多种活性物质赋予其极为特殊的寄生生活习性。以成功构建的日本七鳃鳗唾液腺cDNA文库为基础开展的前期研究中,已证实日本七鳃鳗唾液腺的分泌物质中存在抗凝、抗炎、抗肿瘤以及抗氧化等多种活性分子。然而,对于分泌物中含有的其他蛋白成分及其机制尚不明确。本研究对日本七鳃鳗的唾液腺分泌蛋白的组分进行分析与鉴定,旨在发现和研究与其特殊的寄生生活方式相适宜的特有功能蛋白质。利用生物信息学和分子生物学等手段从蛋白和基因两种水平对日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分进行鉴定分析,获得了分泌物中低含量蛋白的组成信息,并选择新活性氧调节基因、血清白蛋白和细胞死亡调节因子样蛋白进行克隆、进化、表达和活性分析。这有利于揭示日本七鳃鳗唾液腺分泌的功能基因在同系家族中的起源与进化,并为日本七鳃鳗特殊的寄生生活习性提供更多的理论基础。本研究利用SDS-PAGE电泳技术进行日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的分离,以基质辅助激光解析电离化/飞行时间（MALDI-TOF-MS）质谱测序手段进行低含量蛋白的质谱测序,将结果在Mascot数据库进行串联质谱检索（MS/MS Ion Search）,从而鉴定日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的蛋白组成。选择的六条胶带经质谱测序分别获得了312、129、137、283、299和248个蛋白质肽段,其中重要的匹配记录分别为20、9、7、9、20和10项;与唾液腺cDNA文库比较后发现匹配上的和未匹配上的肽段总数目皆为19个;最后将未匹配的蛋白重新查询,最终获得了细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞周期相关蛋白、细胞增殖、分化和凋亡相关蛋白和脂质代谢相关蛋白等共计21种有意义蛋白。利用生物信息学手段解析日本七鳃鳗血清白蛋白及类白蛋白基因家族的分子进化与系统发育,获得类白蛋白基因家族成员演化图以及日本七鳃鳗血清白蛋白、鲑鱼血清白蛋白以及斑马鱼维生素D结合蛋白结构域水平上三者之间的进化关系,证实了日本七鳃鳗血清白蛋白在进化上独特而原始的地位。利用基因工程手段,克隆得到的日本七鳃鳗新活性氧调节功能基因Lj-Romo1开放阅读框长243 bp,编码80个氨基酸,分子量大约8.9KDa;具有信号肽,且可作为跨膜蛋白定位于线粒体膜上;一级结构、二级结构预测以及三维立体结构模拟结果均表明了Lj-Romo1基因与其他物种的高度同源性;进化水平的分析则验证了Lj-Romo1的原始进化地位;以semi-PCR技术检测Lj-Romo1在日本七鳃鳗各组织中的表达情况,发现Lj-Romo1在日本七鳃鳗各组织中广泛表达,其中红细胞中相对表达量最高,且模拟病原菌刺激后各组织中Lj-Romo1表达量明显上调,证明Lj-Romo1参与红细胞的氧化还原信号通路;原核表达没有获得Lj-Romo1的重组蛋白,揭示其序列中可能含有稀有密码子;进一步进行真核转染,发现Lj-Romo1基因的亚细胞定位于线粒体上,初步证实了Lj-Romo1参与机体线粒体内的有氧呼吸过程。利用生物信息学手段研究日本七鳃鳗细胞死亡因子Grimin基因序列的基本性质,证实其为具有疏水性的单层跨膜蛋白,不含信号肽和糖基磷脂酰肌醇锚定位点,具有氧化还原酶活性,在细胞内可作为转录子参与能量代谢;二级结构和高级结构都显示Lj-Grimin具有细胞凋亡因子GRIM19基因家族的标志性特征,并且在进化上高度保守;实时荧光定量PCR法检测到Lj-Grimin广泛分布于日本七鳃鳗各组织之中,且在心脏和红细胞中表达量最高。同时,病原菌刺激后在心脏中表达量明显上调,提示Lj-Grimin在日本七鳃鳗的生活史中起关键作用,并参与病原菌引发的的免疫防御反应。日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定,从蛋白和基因两个水平上完善了日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组成信息,有助于我们深入了解日本七鳃鳗特殊的生活习性及其特殊的进化地位,并为深入研究日本七鳃鳗唾液腺分泌的功能基因和蛋白质组学提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 动物唾液腺分泌的特殊功能组分及其作用机制
• 1.1.1 吸血节肢动物
• 1.1.1.1 抗血液凝集分子
• 1.1.1.2 抗血小板分子
• 1.1.1.3 舒血管分子
• 1.1.2 无颌类动物
• 1.1.2.1 抗凝活性因子
• 1.1.2.2 抗炎活性因子
• 1.1.2.3 抗肿瘤活性因子
• 1.1.2.4 多功能活性因子
• 1.1.2.5 氧化还原相关活性因子
• 1.1.3 有毒动物
• 1.1.3.1 毒蛇
• 1.1.3.2 蜘蛛
• 1.1.4 吸血蝙蝠
• 1.2 动物唾液腺功能组分在药用开发中的研究现状与展望
• 1.2.1 防治心脑血管疾病的新药
• 1.2.2 抗肿瘤药和镇痛药
• 1.2.3 新型降压药和糖尿病药
• 1.2.4 基因工程产品
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.3.1 目的
• 1.3.2 意义
• 1.4 参考文献
• 第2章 日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的组分鉴定
• 2.1 研究背景及意义
• 2.1.1 研究背景
• 2.1.2 生物质谱技术及其检索软件
• 2.1.3 研究意义
• 2.2 材料
• 2.3 方法
• 2.3.1 SDS-PAGE 溶液配制
• 2.3.2 SDS-PAGE 电泳胶的配置
• 2.3.3 蛋白质的切胶回收
• 2.3.4 蛋白质的酶解
• 2.3.5 质谱测序及数据库检索
• 2.3.6 质谱测序结果分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 唾液腺分泌物的电泳结果
• 2.4.2 数据库查询结果（Mascot Search Results）
• 2.4.3 多肽段与唾液腺cDNA 文库的比较结果
• 2.4.4 未知肽段数据库重新搜索结果（NCBI Blast Results）
• 2.5 讨论
• 2.5.1 MALDI-TOF-MS 结果数据库查询分析
• 2.5.2 Mascot 数据库查询结果与唾液腺cDNA 文库比较结果分析
• 2.5.3 低含量蛋白成分功能分类
• 2.6 小结
• 2.7 参考文献
• 第3章 日本七鳃鳗血清白蛋白及类白蛋白基因家族分子进化与系统发育
• 3.1 研究背景及意义
• 3.2 材料
• 3.3 方法
• 3.3.1 同源序列比对
• 3.3.2 结构域预测
• 3.3.3 系统发育树的构建
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 同源序列比对结果分析
• 3.4.2 类白蛋白家族成员的进化分析
• 3.4.3 功能结构域预测分析及系统进化
• 3.5 小结
• 3.6 参考文献
• 第4章 日本七鳃鳗唾液腺分泌新活性氧调节功能基因Romo1的分子克隆、 表达及功能初探
• 4.1 新活性氧调节基因 Romo1 的研究背景及意义
• 4.1.1 新功能基因与活性氧
• 4.1.2 新基因 Romo1 的由来
• 4.1.3 新基因 Romo1 基因的功能及作用机制
• 4.1.3.1 诱导细胞内线粒体ROS 的产生
• 4.1.3.2 参与癌症细胞和正常细胞增殖的过程
• 4.1.3.3 参与复制性衰老
• 4.1.3.4 参与调控细胞的凋亡
• 4.1.4 新基因与耐药性的临床应用
• 4.1.5 新基因的研究意义
• 4.2 日本七鳃鳗 Romo1 基因的分子克隆
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 引物设计
• 4.2.2.2 提取总RNA
• 4.2.2.3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 4.2.2.4 目的片段与载体相连及鉴定
• 4.2.3 结果
• 4.2.3.1 日本七鳃鳗唾液腺RNA 提取结果
• 4.2.3.2 RT-PCR 结果
• 4.2.3.3 阳性转化子筛选
• 4.2.4 讨论
• 4.3 日本七鳃鳗 Romo1 推导的氨基酸序列生物信息学分析
• 4.3.1 数据库和软件
• 4.3.2 方法
• 4.3.3 结果
• 4.3.3.1 蛋白质序列的基本性质分析
• 4.3.3.2 结构域分析
• 4.3.3.3 空间结构预测
• 4.3.3.4 分子进化与系统发育分析
• 4.3.4 讨论
• 4.4 日本七鳃鳗 Romo1 基因真核融合表达系统的构建、真核转染及活性初探
• 4.4.1 材料
• 4.4.2 方法
• 4.4.2.1 酶切位点的选择
• 4.4.2.2 设计引物
• 4.4.2.3 PCR 扩增
• 4.4.2.4 目的片段和载体的酶切及回收
• 4.4.2.5 目的片段与载体相连
• 4.4.2.6 转化
• 4.4.2.7 重组表达菌菌落PCR 及双酶切鉴定
• 4.4.2.8 真核转染
• 4.4.2.9 线粒体染色及亚细胞定位
• 4.4.3 结果
• 4.4.4 讨论
• 4.5 日本七鳃鳗 Romo1 基因原核表达载体的构建及诱导表达
• 4.5.1 材料
• 4.5.2 方法
• 4.5.2.1 酶切位点的选择及引物设计
• 4.5.2.3 PCR 扩增
• 4.5.2.4 目的片段和载体的酶切及回收
• 4.5.2.5 目的片段与载体连接并转化至宿主菌
• 4.5.2.6 重组表达菌菌落PCR 及双酶切鉴定
• 4.5.2.7 阳性重组子的诱导表达及SDS 鉴定
• 4.5.3 结果
• 4.5.4 讨论
• 4.6 日本七鳃鳗 Romo1 基因的组织表达
• 4.6.1 材料
• 4.6.2 方法
• 4.6.2.1 引物设计
• 4.6.2.2 分离七鳃鳗外周血红细胞和白细胞
• 4.6.2.3 总RNA 提取
• 4.6.2.4 RNA 质量检测
• 4.6.2.5 semi-PCR 反应条件
• 4.6.3 结果
• 4.6.3.1 各组织样品总 RNA
• 4.6.3.2 各组织样品模板cDNA
• 4.6.3.3 semi-PCR 结果
• 4.6.4 讨论
• 4.7 小结
• 4.8 参考文献
• 第5章 日本七鳃鳗唾液腺Grimin 基因的序列分析、分子进化及组织表达
• 5.1 研究背景及意义
• 5.2 日本七鳃鳗Grimin 氨基酸序列生物信息学分析
• 5.2.1 材料与方法
• 5.2.3 结果
• 5.2.3.1 蛋白质序列的基本性质分析
• 5.2.3.2 结构域分析
• 5.2.3.3 空间结构预测
• 5.2.3.4 分子进化与系统发育分析
• 5.3 实时荧光定量PCR 法检测Grimin 的表达
• 5.3.1 材料
• 5.3.2 方法
• 5.3.2.1 外周血红细胞和白细胞的分离
• 5.3.2.2 提取总RNA
• 5.3.2.3 检测RNA 的浓度
• 5.3.2.4 实时荧光PCR 法检测目的基因的相对表达量
• 5.3.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.6 小结
• 5.7 参考文献
• 第6章 全文总结
• 本论文的创新点
• 附录 1 数据库中搜索到已知物种类白蛋白基因家族氨基酸序列（FASTA 格式文件）
• 附录 2 数据库中搜索到已知物种活性氧调节基因家族氨基酸序列（FASTA 格式文件）
• 附录 3 数据库中搜索到已知物种GRIM19 氨基酸序列（FASTA 格式文件）
• 附录 4 pET32a 原核表达图谱
• 附录 5 pEGFP-N1 绿色荧光真核表达载体图谱
• 附录 6 提取日本七鳃鳗共计42 个组织样品RNA 的OD 值
• 致谢