人源轮状病毒抗原蛋白G3VP7基因在花生中的遗传转化研究

论文摘要

花生（Arachisshypoaea）具有较高的营养价值,是一种廉价的植物蛋白质源,含有 30%左右的蛋白质,因此,花生是生产口服植物疫苗的理想载体。 为了提高外源蛋白的表达量和简化分离纯化过程,实验中使用了植物油体表达载体,它是由大豆油体基因（oleosin）和轮状病毒抗原蛋白 VP7 基因构成的融合基因克隆到 oleosin 启动子驱动的 pBI121 质粒上的植物双元表达载体。将重组质粒导入农杆菌 LBA4404 中,挑取在 YEB 固体培养基（Kan50mg/L,Str50mg/L）生长的单菌落,经 PCR 检测阳性反应菌落用于转化外植体。以花生子叶节为转化受体,对影响农杆菌介导的花生遗传转化的诸多因素进行了优化。试验确定,结合负压处理、农杆菌侵染 10min,共培养 3d,延后选择 2w,侵染时菌液添加 100μmol/L 比较适宜。 以 pBOG3VP7 质粒载体为阳性对照,未转化植株为阴性对照,以带 DIG-dATP标记的 vp7 基因片段为探针,对抗性植株进行 PCR 和 PCR-Southern 检测,6 株 PCR反应呈阳性,其中有 3 株 Southern 杂交有特异性目标带出现,对 PCR-Southern 杂交阳性的植株的基因组 DNA 进行 Southern-blot 分析,有特异性目标带出现,结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上。

论文目录

• 1 前言
• 1.1 植物生物反应器的研究进展
• 1.2 植物油体表达系统的研究进展
• 1.3 轮状病毒疫苗研究进展
• 1.4 花生遗传转化的研究进展
• 1.5 本论文研究目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 三亲融合法将载体质粒导入农杆菌
• 2.2.2 含目的基因的农杆菌转化子的PCR 快速鉴定
• 2.2.3 花生子叶节再生方式
• 2.2.3.1 外植体的制备
• 2.2.3.2 培养方法
• 2.2.4 筛选压卡那霉素（Kan）浓度的选择
• 2.2.5 转化条件的优化
• 2.2.5.1 花生品种的筛选
• 2.2.5.2 菌液侵染时间和共培养时间的优化
• 2.2.5.3 乙酰丁香酮（AS）浓度的优化
• 2.2.5.4 真空浸透对转化率的影响
• 2.2.5.5 延后选择时间的优化
• 2.2.6 农杆菌介导花生的转化及再生
• 2.2.7 转基因植株的分子检测
• 2.2.7.1 转化植株的 PCR 和PCR-Southern 检测
• 2.2.7.2 转基因植物的Southern 印迹检测
• 3 结果与分析
• 3.1 花生再生系统的建立
• 3.2 卡那霉素浓度的确定
• 3.3 农杆菌转化子的 PCR 快速鉴定
• 3.4 花生转化方法的优化
• 3.4.1 花生品种的筛选
• 3.4.2 菌液侵染时间和共培养时间的优化
• 3.4.3 AS 浓度的优化
• 3.4.4 真空渗透对转化率的影响
• 3.4.5 延后选择对转化率的影响
• 3.5 农杆菌介导的花生转化体的筛选
• 3.6 转基因植株的PCR 和 PCR-Southern 检测
• 3.7 Southern blot 检测
• 4 讨论
• 4.1 农杆菌控制与花生的遗传转化效果
• 4.2 花生抗性再生苗的生根
• 4.3 转基因花生生产口服疫苗的可行性分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 作者简介