慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究

论文摘要

Myostatin （MSTN）是肌肉生长抑制素,又称GDF-8,属于TGF-β超家族成员。该基因已被证明是是肌肉生长的负调控因子。自发突变或遗传操作（敲除或下调）造成的MSTN失活,已经被报道可以增加许多种动物的骨骼肌数量。RNA干扰（RNAi）是dsRNA介导的一种序列特异性的转录后基因沉默（PTGS）现象。RNAi技术的出现为研究基因功能提供了一种快速而有效的基因敲除方法。病毒载体已经被开发用于在哺乳动物细胞中递送siRNA,其中利用慢病毒载体表达shRNA则是获得稳定RNA干扰的非常有效的办法。靶向1myostatin的RNA干扰策略将可能用于增加动物的骨骼肌数量。因此,本研究拟探索用慢病毒载体表达shRNA沉默猪胎儿成纤维细胞中myostatin基因的可行性,为深入研究myostatin在猪的骨骼肌发育过程中的作用提供一些细节。通过这一策略,先用表达特异性shRNA的DNA载体瞬时转染PEF细胞,结果成功地抑制了细胞中myostatin的表达,下调效果显著（高达97%,p<0.05）。对于慢病毒载体介导的RNAi, Real-time PCR的结果显示,稳定整合了慢病毒载体的PEF细胞中myostatin被持续地抑制了,说明获得了一个稳定有效的沉默效果（达到了94%,P<0.05）。与此同时,本研究还检测了RNAi的负面效果,试验中用到的两个shRNA表达载体均没有在瞬时转染的细胞产生高水平的IFN-β和OAS2表达。但出乎意料的是,在稳定转导的PEF细胞中检测到了高水平的IFN-β和OAS2表达,分别是未转导细胞的2.49倍和14.43倍（p<0.05）。结论：本试验成功地用慢病毒载体递送shRNA到了PEF细胞中,并触发了有效而稳定的myostatin沉默,但是对于长期使用该慢病毒载体,还需要尽量降低干扰素反应水平。另外,本研究获得的表达shRNA的慢病毒颗粒可以用于制备转基因胚胎,以生产具有“双肌”表型的动物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语的中英文对照
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 肌肉生长抑制素（Myostatin）基因的研究进展
• 1. 肌肉生长抑制素基因的发现过程
• 1.1. "双肌"（double-muscling）现象与肌肉肥大（muscular hypertrophy）
• 1.2. 调控组织生长发育的因子——抑制素假说（The chalone hypothesis）
• 1.3. Myostatin的发现
• 2. Myostatin基因的结构及染色体定位
• 2.1. Myostatin基因结构和蛋白结构
• 2.2. Myostatin基因的染色体定位
• 3. Myostatin在各组织器官的表达规律
• 4. 肌肉生长抑制素基因的应用
• 5. 结论
• 第二章 RNAi研究进展
• 1. RNAi的发现
• 2. RNAi现象的发生机制
• 2.1. siRNA诱导的PTGS
• 2.2. 内源的microRNA通路
• 2.3. siRNA诱导的TGS
• 3. siRNA导入方法
• 3.1. 非病毒载体的导入方法
• 3.2. 借助病毒载体导入
• 4. 结论
• 第二部分 实验研究
• 第三章 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计及表达载体构建
• 1. 材料与仪器
• 1.1. 菌种及试剂
• 1.2. 主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计
• 2.2. DNA片段与载体片段的连接
• 2.3. 质粒DNA的转化
• 2.4. 质粒的快速鉴定
• 2.5. 质粒小量制备提取
• 2.6. DNA的胶回收
• 2.7. 质粒的酶切鉴定
• 2.8. 质粒测序及结果比对分析
• 3. 实验结果与分析
• 3.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计
• 3.2. shRNA表达载体的酶切鉴定
• 4. 讨论
• 第四章 shRNA沉默猪Myostatin基因的研究
• 1. 材料与仪器
• 1.1. 主要实验材料与试剂
• 1.2. 主要实验仪器
• 2. 实验方法
• 2.1. 原代猪胎儿成纤维细胞的分离与培养
• 2.2. 细胞复苏、传代与冻存
• 2.3. Myostatin表达载体pXF2F-MSTN的构建
• 2.4. 细胞转染
• 2.5. 细胞总RNA提取与反转录
• 2.6. Realtime PCR检测瞬时转染shRNA表达载体后PEF细胞中有关基因的表达水平
• 3. 实验结果与分析
• 3.1. shRNA表达载体的功能验证和筛选
• 3.2. 监测shRNA介导的干扰素反应（IFN activation）
• 4. 讨论
• 第五章 表达shRNA的慢病毒载体构建及功能验证
• 1. 材料与仪器
• 1.1. 主要实验材料与试剂
• 1.2. 主要实验仪器
• 2. 实验方法
• 2.1. 表达shRNA的慢病毒载体构建
• 2.2. 重组慢病毒载体的酶切鉴定
• 2.3. 测序验证及结果分析
• 2.4. 慢病毒生产与浓缩
• 2.5. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞
• 2.6. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化
• 2.7. 数据处理
• 3. 实验结果
• 3.1. 慢病毒的shRNA表达质粒的构建结果
• 3.2. 慢病毒表达质粒的酶切鉴定结果
• 3.3. 慢病毒载体介导的RNAi的沉默效果
• 4. 讨论
• 第六章 shRNA慢病毒载体长期、稳定地抑制PEF中Myostatin表达的研究
• 1. 材料与仪器
• 1.1. 主要实验材料与试剂
• 1.2. 主要实验仪器
• 2. 实验方法
• 2.1. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞及Blasticidin筛选稳定细胞系
• 2.2. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化
• 2.3. 数据处理
• 3. 实验结果
• 3.1. 细胞筛选结果
• 3.2. 稳定细胞系中的RNAi效果研究
• 4. 讨论
• 全文结论
• 附录一
• 附录二
• 参考文献
• 致谢