电针对兔膝骨关节炎关节软骨MMP-9及TIMP-1表达的影响

论文摘要

目的：骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种运动系统的慢性退行性疾病,其病因及发病机制十分复杂,是力学和生物学因素共同作用引起关节软骨细胞、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）以及软骨下骨三者合成与降解的正常偶联失去原有平衡的结果。其中,引起OA关节软骨发生退行性变的一个重要原因在于关节软骨ECM合成与降解之间的内稳态被打破。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）是参与关节软骨ECM和基底膜降解过程的所有酶中最重要的一种,其发挥酶类作用的特异性抑制物是金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs）, ECM内环境维持主要依赖于MMPs/TIMPs的动态平衡,二者在OA软骨发生退行性变过程中都起着非常重要的作用。电针通过毫针刺激将低频脉冲微电流传入相应穴位,使皮肤、肌肉、关节囊、韧带等本体感受器受到刺激后使大量的本体运动和皮肤感觉的信息传入中枢,从而发挥调节肌张力、缓解痉挛、通络止痛等作用,是一种对早、中期OA有效的非药物治疗方法,但目前仍以临床研究为主,机制方面的研究甚少。本课题通过HE染色、免疫组织化学技术检测电针治疗前后兔膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）关节软骨大体形态、软骨细胞病理改变情况以及软骨组织中MMP-9和TIMP-1表达含量的变化进行观测,探讨电针在细胞、分子水平上治疗KOA的作用机制,为今后的实验研究打下坚实的基础,也为临床工作提供一定的理论依据。方法：（1）对象和干预措施：选取健康新西兰大耳兔30只,按照随机数字表法分为三组,即正常组、模型组和电针干预组。正常组常规喂养不实施任何干预措施,其余两组兔左侧膝关节进行伸直位管型石膏固定,构建OA模型。喂养6周后,用5m1空针向兔耳缘静脉注入适量空气处死模型组,切开暴露左侧膝关节,取内侧髁软骨,对造模后的相关指标变化情况进行观察。同时,电针干预组取造模关节附近“梁丘”、“足三里”、“血海”、“阳陵泉”四个临床常用穴位,用30号一寸毫针针刺,接着将G9805-C型低频电子脉冲治疗仪与针柄相连,调至疏、密波交替模式,频率分别选择4Hz、20Hz,脉冲宽度0.5ms,20min/次,1次/日,干预10次后用与模型组相同的方法处死电针干预组,取膝关节内侧髁软骨观测其各方面的变化情况。（2）观察指标：①三组兔左侧膝关节均通过肉眼大体观察形态改变情况;②切取左膝股骨内侧髁关节软骨,置于40g/L多聚甲醛固定液内,10%EDTA脱钙液脱钙后,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察软骨细胞形态、潮线完整性等,按彭太平组织病理结构分级和Mankin’s评分标准分别对观察结果进行分级、评分。③免疫组织化学检测：用兔抗MMP-9及TIMP-1试剂分别进行相关实验,测二者在正常组、模型组和电针干预组兔左膝股骨内侧髁关节软骨的表达情况。（3）统计学方法：用SPSS15.0软件,计量资料以均数土标准差（x±s）表示,对数据进行处理分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：（1）软骨结构大体观察：正常组兔膝关节腔内无明显关节积液,通过大体观察发现软骨表面平整,呈蓝白色且泛亮光,无裂纹,关节面及滑膜为Ⅰ级,软骨结构Mankin’s评分为0分。模型组经伸直位管型石膏固定6周后膝关节腔内几乎均可见有积液,关节面不光滑且略欠平整,少数部位可见糜烂,外观均较灰暗,颜色偏黄,光泽度较正常组差,关节面及滑膜为Ⅲ级；电针干预组部分造模关节可见关节腔积液,滑膜增生,光泽度与正常组相比仍有差异,未见明显糜烂,软骨表面不光滑,欠平整,与模型组相比已有所改善；根据Mankin’s评分标准比较模型组及电针干预组关节软骨结构,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色病理学观察：正常组兔左侧膝关节软骨表面平整,软骨层厚度基本一致,软骨细胞大小接近,排列规则,深层细胞、中间层细胞、表层细胞分别呈柱形、圆形、梭形,中间层分布较散,表层接近平行排列,潮线完整,Mankin’s评分记为0分；模型组染色结果显示软骨表层有小裂隙,软骨层厚度与正常组相比明显变薄,软骨细胞数量下降,细胞排列无规则,局部呈现大量簇聚,潮线紊乱,Mankin’s评分较正常组增加（P<0.05）,电针干预组软骨表面较规则,裂隙少,成簇少见,软骨细胞排列整齐,Mankin’s评分较模型组减小（P<0.05）,但与正常组比较,软骨细胞数较模型组明显增多,软骨层厚度较模型组增加,可见潮线紊乱,Mankin’s评分增加（P<0.05）。（3）免疫组化MMP-9及TIMP-1测定：正常组关节软骨细胞胞浆中偶见浅棕黄色MMP-9及TIMP-1弱阳性染色；模型组大量软骨细胞中可见棕色MMP-9强阳性染色颗粒,尤以深层密度最高,成熟软骨细胞中较多,为深棕褐色颗粒,少量细胞可见棕黄色TIMP-1阳性染色；电针干预组部分软骨细胞中可见棕黄色MMP-9阳性染色,以及大量深棕色TIMP-1强阳性染色颗粒。电针干预组MMP-9表达量较模型组减少,与正常组比表达量增加（P<0.05）,电针干预组TIMP-1表达量较模型组增加,与正常组比呈高表达（P<0.05）。结论：（1）本实验采用石膏对兔膝关节进行伸直位机械性制动6周可成功复制OA模型。（2）MMP-9与TIMP-1的基础分泌量对维持关节软骨的完整性至关重要,如果MMP-9/TIMP-1二者之间失衡会造成与关节软骨相应的ECM过度降解,从而促进关节软骨退变。（3）电针能减缓兔KOA关节软骨退变,促进关节软骨损伤后的修复,其作用机制可能与减少软骨中MMP-9含量、增加TIMP-1含量有关,有效调整了MMPs/ TIMPs二者的平衡,抑制了ECM的过度降解、减小了关节的损伤。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1 实验动物与材料
• 2 实验方法
• 3 统计学分析
• 结果
• 1 一般情况
• 2 关节软骨结构大体观察
• 3 病理切片光镜观察结果
• 讨论
• 1 骨关节炎及模型建立
• 2 OA关节软骨中MMP-9及TIMP-1表达的意义
• 3 电针治疗OA
• 4 电针对兔KOA关节软骨MMP-9及TIMP-1表达的影响
• 结论
• 参考文献
• 英汉缩略词对照表
• 致谢
• 综述 骨关节炎动物模型的建立与比较
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文