论文摘要
研究目的发达国家和地区中大肠癌发病率是肿瘤中的第二位,临床上大肠癌肝转移疗效不佳,5年生存率不足10%,60%的大肠癌患者致死原因为肝转移。抗血管生成疗法是临床上新的有效治疗方法,如:表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体cetuximab,panitumumab和nimotuzomab。血管内皮细胞生长因子（VEGF）抗体bevacizumab（商品名Avastin）被美国FDA批准为晚期结直肠癌的一线治疗药物。基因治疗是新型有希望的肿瘤治疗方案。研究抗血管生成基因治疗是治疗中晚期实体瘤的需要。据报道人肝细胞生长因子第1螺旋区（HGFK1）具有抗血管生成作用,腺病毒体外和体内都增强rAAV的转染,我们发现rAAV-HGFK1对大鼠肝癌原位模型具有显著疗效,对EGFR磷酸化具有显著的抑制作用。本课题为了深入研究其抗血管生成的机制,实验rAAV-HGFK1和Ad-p53对EGFR和HGFR的作用,验证Ad-p53是否能增强rAAV-HGFK1疗效,评价和比较了3种基因治疗方案:（1） rAAV-HGFK1,（2） Ad-p53,（3）rAAV-HGFK1+Ad-p53对大肠癌动物模型的疗效,远期目标是开发出新的抗血管生成基因治疗方案。方法体外选择人源的Lovo大肠癌细胞、小鼠的CT26大肠癌细胞和SV40大T抗原（tsA-58-3）转化的小鼠胰岛内皮细胞MILE SVEN1（MS1）、SV40转化的能成瘤的小鼠内皮细胞株SVEC4-10EE2（SV10）内皮细胞实验,提取此4种细胞株总RNAs,逆转录为cDNA,RT-PCR半定量测定EGFR、HGFR基因转录水平。重组rAAV颗粒通过无辅助病毒的系统生产,腺病毒由表达载体pAd/CMV/V5-DESTTM（Invitrogen）转染293A细胞产生,制备纯化好病毒后,1000vg/细胞或10000vg/细胞的rAAV-EGFP单独感染或和10pfu/细胞的Ad-null同时感染Lovo、CT26细胞,培养4天和7天,在荧光显微镜下观察EGFP表达情况,计算细胞rAAV-EGFP感染率。分别用2×103vg/细胞的AAV和10pfu/细胞Adv感染以上4种细胞株,分为下面4组:rAAV-EGFP+Ad-null、rAAV-EGFP+Ad-p53、rAAV-HGFK1+Ad-null或rAAV-HGFK1+Ad-p53,孵育48小时后,用不同浓度的HGF或EGF加入培养液中继续培养,刮取细胞,提取总蛋白,SDS-PAGE电泳,转移到硝酸纤维素膜上,经过封闭后,Western blot检测EGFR、P-EGFR、c-Met（HGFR）、P-c-Met和β-actin。同上的方法分组,病毒感染72小时后,加入不同浓度的EGF或HGF时细胞继续培养72小时后加入MTT,酶标仪测吸光度,计算细胞的增殖率。MS1或SV10细胞分为以上4组病毒感染后3天,待细胞融合后用无菌枪头划痕,形成约1mm宽的无细胞区,0h、10h、20h在100×倒置显微镜下观察细胞迁移情况。体内试验选择人大肠癌细胞Lovo和小鼠大肠癌细胞株CT26,通过手术每只裸鼠或小鼠分别注射1×106个Lovo或5×105个CT26细胞到脾被膜下,制备肝转移小鼠模型,每组3只小鼠通过小鼠尾静脉注射rAAV-HGFK1,分为三个剂量,分别为（1）Ad-p53:2.5×109vp/只,（2）低剂量rAAV-HGFK1+Ad-p53:5.0×1010vg+2.5×109vp/只,（3）高剂量rAAV-HGFK1+Ad-p53:1.5×1011vg+2.5×109vp/只,试验rAAV-HGFK1剂量疗效关系,然后,选择高剂量rAAV进行每组6只小鼠的四组基因治疗生存时间试验,四组分别为（A）rAAV-EGFP、（B）rAAV-HGFK1、（C）rAAV-EGFP+Ad-p53、（D）rAAV-HGFK1+Ad-p53,再用以上CT26大肠癌肝转移小鼠模型每组5只,做此四组基因治疗,接种细胞后12天和20天进行疗效观察,称每只小鼠脾和肝重量,并留取脾、肝和胰标本石蜡切片,HE染色观察肿瘤细胞坏死情况,用抗CD31、抗vWF的抗体免疫组化染色,先在低倍光镜下（40倍）确定肿瘤内新生血管最密集区,在高倍视野（200倍）计数5个视野新生血管数进行比较,用抗HGFK1、抗EGFP抗体免疫组化染色测定AAV感染情况和目的基因表达情况,用TUNEL染色检测凋亡细胞,每组每张切片随机取5个200×高倍镜视野计数凋亡细胞数、总细胞数（200个）,凋亡细胞数与总细胞数之比即凋亡率。rAAV-EGFP和Ad-null感染各组比较用析因分析,rAAV-HGFK1和Ad-p53各组间比较均采用单因素方差分析,小鼠生存时间比较用log-rank法,生存曲线采用Kaplan-Meier法。结果病毒感染7天后,rAAV-EGFP 1000vg/细胞和Adv 10pfu/细胞感染组CT26或Lovo细胞EGFP的阳性率分别是rAAV-EGFP 1000vg/细胞感染组的2倍或4倍。而且,大剂量组rAAV-EGFP 10000vg/细胞和Adv 10pfu/细胞感染组CT26或Lovo细胞EGFP的阳性率分别是rAAV-EGFP 10000 vg/细胞感染组的2.5倍或4.5倍,加入Ad-null到rAAV-EGFP显著增加了rAAV-EGFP对CT26和Lovo细胞转染率,rAAV-EGFP和Adv两因素对细胞感染有协同作用,说明在所设计的浓度范围内增加rAAV-EGFP或Adv的量都可以显著增加感染率。RT-PCR检测发现,人大肠癌细胞Lovo高转录EGFR和HGFR,但小鼠大肠癌细胞CT26不转录EGFR和HGFR;小鼠成血管瘤内皮细胞SV10转录EGFR和HGFR,而小鼠胰岛内皮细胞MS1低转录HGFR和EGFR。Wesern blot检测c-Met和EGFR以及磷酸化c-Met和EGFR,发现CT26不表达c-Met,其余细胞c-Met和EGFR表达各组之间无显著差异,rAAV-HGFK1和Ad-EGFP或Ad-p53联合组与rAAV-EGFP和Ad-EGFP或Ad-p53联合组对照,rAAV-HGFK1抑制了c-Met磷酸化,显著抑制了EGFR磷酸化,显示rAAV-HGFK1是EGFR和HGFR磷酸化的抑制剂。MTT法检测细胞增殖率发现,104Vg/细胞rAAV-HGFK1和103vp/细胞Ad-p53感染后,2%FBS培养基培养3天,CT26和Lovo细胞增殖无显著差异,2ng/ml和20ng/ml的HGF对CT26细胞和MS1细胞增殖无显著影响。但是,rAAV-HGFK1显著抑制了无血清培养液中HGF对Lovo和SV10的刺激增殖作用,也显著抑制了0.2%血清培养液中4ng/ml和40ng/ml的EGF对SV10和MS1细胞的刺激作用,同样显著抑制了0.2%血清培养液中2ng╱ml和20ng╱ml的HGF刺激SV10细胞增殖的作用。划痕修复实验显示,rAAV-EGFP和Adv感染组在20小时后,绝大部分划痕区被细胞覆盖,而在rAAV-EGFP+Ad-p53或rAAV-HGFK1+Ad-EGFP感染组,较少的细胞进入划痕区。Ad-p53和rAAV-HGFK1感染组最少的细胞进入划痕区,表明rAAV-HGFK1或Ad-p53对SV10和MS1细胞的迁移都有抑制作用,Ad-p53增强了rAAV-HGFK1的这种抑制作用。rAAV-HGFK1零剂量、低剂量和高剂量组治疗CT26大肠癌转移的BALB/c小鼠的平均生存期为23、36.7和53天,治疗Lovo大肠癌转移的裸鼠平均生存期为34、38.6,和47天。结果提示使用高剂量rAAV-HGFK1联合Ad-p53治疗大肠癌转移模型有较好的疗效。生存试验中,rAAV-HGFK1联合Ad-p53治疗分别和两者单药治疗组比较,在Lovo肝转移和CT26肝转移两种模型中都显著延长了小鼠的生存时间（P均＜0.05,log-rank生存分析）。rAAV-HGFK1联合Ad-p53治疗组有一个BALB/c小鼠和两个裸鼠仍然健康存活,人道处死小鼠后肉眼未发现体内有肿瘤。在各个治疗组之间,细胞接种后12天时脾脏和肝脏的重量有显著性差异,但rAAV-HGFK1和Ad-p53联合治疗组和两者之一单药治疗组比较没有显著性差异,rAAV-HGFK1和Ad-p53联合组中,4/6的小鼠在手术后12天肉眼未见有肿瘤,其余小鼠12天时都发现了肉眼可见的肿瘤。但20天时,联合治疗组脾脏和肝脏的肿瘤重量比其他各组包括两个单药治疗组都显著较轻（P＜0.01）。石蜡切片H&E染色观察到rAAV-EGFP组脾细胞被CT26细胞替代,CT26已经侵袭肝脏大部分,联合治疗组肝脏肿瘤数目较少,肿瘤细胞坏死区较明显。用抗EGFP染色,因为EGFP不能分泌到细胞外,棕色的阳性胰腺细胞和阴性胰腺细胞分界非常清楚,而且阳性细胞都是细胞浆阳性,细胞核无棕色染色。有意思的是rAAV-EGFP+Ad-p53组的阳性细胞数目明显多于rAAV-EGFP组。肝切片用抗HGFK1抗体免疫组化染色,在rAAV-HGFK1组和rAAV-HGFK1+Ad-p53组中,rAAV携带HGFK1在体内都有效表达,由于病毒是通过尾静脉注射入体内,肝是此型rAAV的主要感染器官,所以肝内大血管和小血管周围的肝细胞在rAAV-HGFK1+Ad-p53组比rAAV-HGFK1组血管周围阳性细胞数目多,很可能是Ad-p53在体内增强了rAAV-HGFK转染效率。因为rAAV表达的HGFK1可以被分泌到细胞外,所以阳性细胞和阴性细胞之间界限不是很明显。石蜡切片用TUNEL染色,凋亡细胞染为棕色,rAAV-HGFK1+Ad-p53组中肿瘤占位区凋亡细胞数显著多于rAAV-HGFK1组,在rAAV-EGFP对照组,肿瘤占位区中凋亡数目小于2%。抗CD31组化染色显示,对照组有大量新生血管,rAAV-EGFP+Ad-p53和rAAV-HGFK1治疗组都有较多新生血管在肿瘤组织中生长,rAAV-HGFK1组比rAAV-EGFP组显著减少,更重要的是rAAV-HGFK1+Ad-p53治疗组新生血管数目比rAAV-HGFK1和rAAV-EGFP+Ad-p53组显著减少。为了排除HGFK1和p53基因表达下调CD31表达的可能性,我们用另一个新生血管内皮细胞标志vWF的抗体免疫组化染色,也得到类似的结果。结论rAAV-EGFP和Ad-null对大肠癌细胞Lovo和CT26的转染有协同作用,Ad-null显著增强了rAAV-EGFP对细胞的感染率。rAAV-HGFK1显著抑制了HGF和EGF对高表达EGFR和HGFR的Lovo和SV10的刺激增殖作用,显著抑制了EGFR和HGFR的磷酸化。rAAV-HGFK1或Ad-p53对SV10和MS1细胞的迁移都有抑制作用,Ad-p53增强了rAAV-HGFK1的这种抑制作用。rAAV-HGFK1或Ad-p53单药治疗组均有一定的疗效,两者联合治疗组和rAAV-HGFK1或Ad-p53单药治疗组以及对照组小鼠比较,显著延长了生存时间,Ad-p53增强了体内rAAV-EGFP和rAAV-HGFK1表达。联合治疗组比单药治疗组显著减慢了肝脏和脾脏中肿瘤的生长,显著抑制了肿瘤内新生血管生成,显著增加了肿瘤细胞凋亡。rAAV和Ad联合治疗是新型肿瘤基因治疗方案。