论文摘要
[研究背景]肥胖目前在全世界呈流行趋势,其既是一个独立的疾病,又是2型糖尿病、心血管病、高血压、中风和多种癌症的危险因素,已被世界卫生组织列为导致疾病负担的十大危险因素之一。我国目前体重超重者已达22.4%,肥胖者为3.01%,因此预防和控制肥胖症已成为刻不容缓的任务。但针对肥胖的干预治疗措施效果不佳,急需研发新的安全有效易耐受的治疗措施。同时对于肥胖的具体发病机制尚未完全明了,目前大家一致认同：人体肥胖的发生是由于机体能量代谢的失衡所致,摄入体内的热量多于被消耗的热量从而促使脂肪合成增加是造成肥胖的物质基础。所以体重控制的关键在于维持机体能量代谢的平衡,而对于肥胖患者体内能量代谢障碍的研究正成为肥胖相关研究的热点。新近的研究发现胆汁酸不仅参与机体脂质的乳化吸收,其还通过多种胞膜、胞内蛋白共同作用所介导的信号事件在机体的糖代谢、脂代谢以及能量代谢中具有重要的调节作用。胆汁酸可通过与细胞表面的G蛋白耦联受体家族的新成员TGR5特异性结合而提高细胞内的2型脱碘酶的活性,促使甲状腺激素T4转化为机体能量调节主要的内源活性物质T3,T3又可通过作用于多种细胞及器官,加速机体能量的代谢以及脂肪的消耗,从而抑制体重的增加。因此对胆汁酸分子参与介导的信号通路效应的深入研究有助于为肥胖的治疗与干预探寻新的生物治疗靶点。但是目前关于胆汁酸参与机体能量代谢的研究结果几乎全部来源于动物模型或细胞株,缺乏胆汁酸代谢与人体能量代谢间关系的直接研究,而且尚缺乏适用于临床实验室检测分析肥胖患者体内不同胆汁酸亚组分表达特征的平台方法。[研究目的]本研究拟通过检测单纯性肥胖者体内总胆汁酸水平、胆汁酸亚型表达特征、甲状腺激素水平和血清中TGR5水平,初步探讨单纯性肥胖者体内的胆汁酸表达特征及甲状腺功能状态之间的关系,为进一步了解胆汁酸分子介导的信号事件对人体整体能量代谢的影响,和为探寻单纯性肥胖的治疗靶点提供实验依据和线索。同时建立适用于临床实验室分析患者体内胆汁酸特征表达谱的检测方法,为进一步的研究提供技术以及方法学条件。[对象与方法]研究对象为我院体检中心体检人群,其中健康人对照组10例（BMI在18.5～23.9 kg/m2）、超重组10例（BMI在24.0～27.9 kg/m2）、单纯性肥胖组10例（BMI在28.0 kg/m2以上）。采用超高效液相色谱—串联质谱方法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS）检测人血清中胆汁酸亚组份的表达水平；采用酶循环放大法检测人血清中总胆汁酸浓度；采用微粒子酶免疫方法（Microparticle Enzyme Immunoassay, MEIA）检测人血清中甲状腺激素浓度；采用酶联免疫吸附方法（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA）检测人血清中TGR5水平。应用SPSS13.0统计软件分析数据,用x±s或中位数（四分位数间距）描述结果,采用Shapiro-wilk进行数据的正态性检验,符合正态分布的数据采用t检验或方差分析（one-way ANOVA）,不符合正态分布的采用Kruskal-Wallis H检验进行多组间比较,Nemenyi法进行组间两两比较。[研究结果]1.建立基于超高效液相色谱/串联质谱（UPLC-MS/MS）方法的胆汁酸亚组份检测分析方法平台,具体的性能评价结果如下：①分析准确度：该方法在高、中、低三个浓度水平下检测胆汁酸的相对回收率,其准确度为89.8%～114.6%；②分析精密度：日内以及日间分析检测的变异系数CV均低于15%；③分析灵敏度：该方法的最低检测限LOD以及最低定量检测限LOQ可达到1nmol/L小数点后两位,满足病人样本检测的要求；④分析测量范围：各胆汁酸亚组分在10 nmol/L～3000nmol/L和3000 nmol/L～20000 nmol/L范围内具有良好的线性测量表现,决定系数R2均大于0.95；⑤单样本上机分析检测时间仅需要约5分钟。2.肥胖患者血清中胆汁酸亚组分表达分析显示,在健康对照以及超重和肥胖组患者血清中CA，DCA、CDCA、UDCA、LCA、GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TDCA、TCDCA、TUDCA和TLCA共14种胆汁酸亚组分均有表达,其中的LCA、TCA、TLCA和TUDCA的表达水平最低（P<0.05）。14种胆汁酸亚组分在健康对照组、超重组和肥胖组间的差异表达无统计学意义（P>0.05）。3.对受试者血清中游离胆汁酸和结合胆汁酸的表达分析显示,超重组以及肥胖组患者血清中的游离胆汁酸和结合胆汁酸表达水平均低于健康对照组（P>0.05）。总胆汁酸表达水平在健康对照以及超重组和肥胖组间无显著性差异（P>0.05）。4.对受试者血清中的TGR5受体表达分析显示,超重组以及肥胖组患者血清中TGR5表达水平增加,与健康对照组相比,超重组TGR5水平升高不具有统计学意义,但是肥胖组患者血清中TGR5水平的升高具有统计学意义（P<0.05）。5.对受试者血清中的甲状腺激素表达水平分析显示,超重以及肥胖患者血清中的FT3水平与健康对照者血清中的FT3表达水平相比略有降低,但差异不具有统计学意义（P>0.05）；但与健康对照者相比,超重以及肥胖患者血清中的FT4和TSH表达水平升高（P>0.05）,而且肥胖患者血清中的FT4/FT3比例显著性升高（P<0.05）。6.肥胖患者血清中的游离脂肪酸（FFA）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）均显著性高于健康对照组（P<0.05）；超重组患者血清中的游离脂肪酸、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）也高于健康对照组,但是只有游离脂肪酸水平的升高具有统计学意义（P<0.05）,血清中的葡萄糖表达水平在健康对照以及超重和肥胖患者间无明显差异（P>0.05）。相关分析显示血清中FFA表达水平的变化与患者的体重指数呈明显的正相关趋势（r=0.441,P<O.05）,而且血清中的FFA表达与TC和TG的表达也呈明显的正相关（r=0.409, P<0.05;r=0.520, P<0.05）。同时血清中的TC和TG水平也与患者的体重指数呈明显的正相关趋势（r=0.533,P<0.05；r=0.430,P<0.05）。[结论]1.本实验成功建立基于超高效液相色谱/串联质谱（UPLC-MS/MS）方法的胆汁酸亚组份检测分析方法平台,该方法对于胆汁酸的检测分析具有良好的准确度、灵敏度和精密度,同时该方法具有很宽的线性检测范围,以及分析时间较短等特点,适用于临床实验室对患者胆汁酸特征谱的检测分析。2.肥胖患者体内胆汁酸代谢紊乱,由胆汁酸分子以及TGR5介导的信号通路可能存在障碍。肥胖患者体内游离胆汁酸和结合胆汁酸均低表达,且患者血清中游离TGR5受体的表达增加,其不利于BA和TGR5介导的信号通路的启动以及2型脱碘酶的活化；同时我们的研究显示患者体内FT3表达降低,但FT4和TSH表达水平升高（P>0.05）,同时血清中FT4/FT3比例增加（P<0.05）,提示患者体内的FT4并未有效的转化为FT3,从而诱导患者体内能量消耗的障碍以及肥胖的发生。3.肥胖患者体内甲状腺激素代谢紊乱直接诱导了机体能量的堆积以及肥胖的发生。患者体内由FT4向FT3转化的障碍使得患者体内能量代谢的主要调节物FT3相对缺乏,使得由FT3介导的能量代谢受损,体内能量堆积并诱发肥胖患者血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）表达升高以及患者体重的增加。4.肥胖患者体内高表达的TSH诱导了患者体内的游离脂肪酸的高表达,并增加了肥胖患者发生糖尿病的风险。