毕赤酵母异源表达灵芝漆酶及酶学特性与功能的研究

论文摘要

漆酶（Laccase）是一种含多个铜原子的多酚氧化酶,目前已经有报道多种来源的漆酶能够在体外催化降解多种污染物,包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羟酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、金属有机化合物及其他非酚类底物等。构建灵芝漆酶表达质粒,在毕赤酵母中异源表达并得到纯化的漆酶,从而进一步研究灵芝漆酶的酶学特性及对几种染料的降解情况,可以为灵芝漆酶高效工程菌株的构建、灵芝漆酶工业化生产提供平台。本研究根据NCBI数据库公布的灵芝菌株7071-9的漆酶基因序列设计引物,通过PTDS方法合成了灵芝漆酶GILCC基因,并且进行了毕赤酵母的偏爱密码子改造。为了进一步研究GlLCC蛋白的酶学特性与功能,通过电击转化法将带有目的基因GILCC的重组质粒表达载体转化毕赤酵母,添加了AOXI启动子使其在毕赤酵母中进行甲醇诱导分泌表达。对表达的灵芝漆酶使用6xHis与镍柱结合的方法进行纯化与酶蛋白定量,通过对其进行SDS-PAGE电泳,得到灵芝漆酶的分子量在58KD左右。对灵芝漆酶酶学性质分析,得到了其对于特异性底物ABTS的最适反应温度与pH值分别为55℃和2.6,在25℃时温度稳定性最高,对酸性范围内的pH具有良好的稳定性,对金属离子Fe2+和Fe3+高度敏感产生抑制作用,K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+可以提高酶的活性。GILCC对底物ABTS的酶反应动力学常数Km值为0.9665mM, Vmax为3024μMmg-1min-1,而对愈疮木酚的Km值为1.112mM, Vmax为82.13μMmg-1min-1。针对漆酶类对染料的独特降解作用,对灵芝漆酶作用于不同染料（偶氮类、三苯甲烷类）降解进行了研究。对甲基橙、孔雀石绿、结晶紫、亮绿4种染料进行了脱色实验,确定了最适脱色条件并探讨了反应时间、金属离子对染料脱色的影响。结果表明,灵芝漆酶对这4种染料均表现出一定的脱色性能,甲基橙在最佳反应条件下的脱色率在50%左右,而孔雀石绿、结晶紫及亮绿在最佳反应条件下,脱色率均达到了70%以上,其中孔雀石绿与结晶紫最高可达90%脱色率。金属离子Cu2+可以大大影响灵芝漆酶对甲基橙和亮绿的脱色率,特定量的Zn2+可以提高漆酶对孔雀石绿的脱色率,而抑制了对结晶紫的降解。灵芝漆酶对各种染料的脱色还通过了HPLC进行了验证,可以明显的发现特征峰面积的减小,说明了各种染料的降解情况。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1. 漆酶的性质、催化机理及功能
• 1.1 漆酶的来源及分布
• 1.2 漆酶的性质
• 1.2.1 漆酶的结构与活性中心
• 1.2.2 漆酶的理化性质
• 1.2.3 漆酶的催化底物
• 1.2.4 漆酶的催化机理
• 1.3 漆酶的功能
• 1.3.1 环境保护
• 1.3.1.1 漆酶对木质素的降解
• 1.3.1.2 漆酶对废水及有害物质的处理
• 1.3.1.3 漆酶对染料的脱色处理
• 1.3.2 医疗卫生
• 1.3.3 化学合成
• 1.4 灵芝漆酶
• 2. 本论文主要研究目的、内容及意义
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 研究意义
• 第二章 GlLCCⅠ基因的合成、表达及纯化
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 引物设计及PCR
• 1.3 克隆与序列分析
• 1.4 GlLCCⅠ基因异源表达和纯化
• 1.4.1 GlLCCⅠ基因转化入毕赤酵母
• 1.4.2 GlLCCⅠ基因胞外表达及纯化
• 1.4.3 灵芝漆酶SDS-PAGE及蛋白定量
• 1.4.3.1 灵芝漆酶SDS-PAGE电泳
• 1.4.3.2 灵芝漆酶蛋白定量
• 2 结果与分析
• 2.1 GlLCCⅠ基因的合成
• 2.2 GlLCCⅠ基因的电击转化与表达
• 2.3 灵芝漆酶蛋白的纯化与定量
• 3. 讨论
• 第三章 灵芝漆酶酶学性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 常用储备液及配法
• 1.3 灵芝漆酶的最适pH和温度
• 1.4 灵芝漆酶对两种不同底物特异性的研究
• 1.4.1 灵芝漆酶对ABTS饱和曲线的绘制及米氏方程
• 1.4.2 灵芝漆酶对愈疮木酚饱和曲线的绘制及米氏方程
• 1.5 灵芝漆酶对pH与温度稳定性的测量
• 1.6 金属离子对灵芝漆酶的影响
• 1.7 不同有机、无机化合物对漆酶活性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 灵芝漆酶的最适pH和最适温度
• 2.2 对两种底物特异性的研究及米氏方程
• 2.2.1 以ABTS为底物的饱和曲线绘制及米氏方程
• 2.2.2 愈疮木酚饱和曲线的绘制及米氏方程
• 2.3 灵芝漆酶的温度稳定性与pH稳定性
• 2.4 不同浓度金属离子对漆酶活性的影响
• 2.5 有机、无机化合物对灵芝漆酶活性的影响
• 3 讨论
• 第四章 灵芝漆酶对染料降解的研究
• 1. 灵芝漆酶对四种染料的降解
• 1.1 实验材料与方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 甲基橙、孔雀石绿、结晶紫、亮绿化学结构、全波长扫描及吸光度特性分析
• 1.2.2 漆酶对不同浓度染料降解的作用
• 1.2.3 不同pH对漆酶降解染料的影响
• 1.2.4 不同温度与不同作用时间对染料降解的影响
• 1.2.5 不同金属离子对漆酶降解染料的影响
• 1.2.6 灵芝漆酶对染料降解程度的HPLC检测
• 2. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢