论文摘要
背景和目的:因现代战争及和平时期交通、建筑等行业的高能量损伤、骨肿瘤切除、骨结核与感染等所致的骨缺损日益常见。作为治疗骨缺损金标准的自体骨移植,由于存在取骨量有限和取骨区并发症,已不能满足骨缺损治疗的需要。利用骨髓干细胞与生物材料结合构建的组织工程骨修复骨缺损的动物实验已获得较为肯定的效果,但其缺点在于MSCs来源少、体外培养扩增周期长、细胞对支架材料的粘附率不足、技术条件高,从而影响了其在骨缺损治疗中的应用。自体红骨髓经皮注射在临床治疗骨不连和填充骨缺损等方面已取得一定的成功,但应用直接注入的方法,局部干细胞容易流失,影响了疗效。SCR是骨髓干细胞富集技术之一,是通过基质材料适当的网孔结构和良好的表面粘附性能,使骨髓流经时选择性滞留利于成骨的干细胞及促成骨因子等成分,所构建的TEB即刻回植修复骨缺损,可获得与自体骨移植相接近的效果。但由于受到知识产权保护和入关限制的影响,该技术及相关产品至今难以在我国临床应用。为此,本实验主要目的包括:⑴制备一种新型的骨髓干细胞富集材料,并观察其体外细胞相容性和体内组织相容性;⑵探讨SCR技术快速构建的TEB的异位成骨效果;⑶探讨新型富集材料应用SCR技术处理后对骨髓细胞和促成骨生长因子的富集效果;⑷观察SCR技术快速构建的TEB对成骨标志物和成骨特异性转录激活因子Cbfα1表达的影响,探讨富集材料促成骨的可能机制。方法:⑴采用多聚左旋赖氨酸修饰人脱钙骨基质制备一种新型的骨髓干细胞富集材料,用液体置换法、扫描电镜、三维视频显微镜、拉曼光谱、红外光谱和HE染色测定其密度、孔隙率、孔径等表面特征;⑵将富集材料和不同浓度的材料浸提液与hMSCs共培养,应用形态学观察、MTT法、流式细胞仪、免疫组织化学、溶血实验等评价材料的体外细胞相容性;⑶裸鼠分别予腹腔注射PLL-DBM的生理盐水浸提液、背部皮下注射PLL-DBM浸提液培养后的DOC细胞悬液、背部植入PLL-DBM材料后,采用全身急性毒性试验、致癌试验和皮下植入试验等评价材料的体内组织相容性。⑷采用SCR技术使PLL-DBM富集骨髓后快速构建TEB,分别将SCR技术构建的TEB（SCR组）、体外培养的MSCs复合DBM常规构建的TEB（TEB组）、注射骨髓复合DBM（骨髓组）、单纯DBM（DBM组）植入裸鼠皮下,4、8、12、16w时取材,应用X线摄片、CT扫描、扫描电镜和HE染色等方法,观察植骨处影像密度、植骨区组织学改变和成骨效果;⑸应用SCR技术处理富集材料,观察富集前后PLL-DBM对骨髓有核细胞、血小板及纤维母细胞集落形成单位的富集效果,ELISA法检测富集前后骨髓上清中TGF-β1和PDGF表达;⑹采用SCR技术富集骨髓后快速构建TEB,分别将SCR技术构建的TEB（SCR组）、MSCs复合DBM常规构建的TEB（TEB组）、注射骨髓复合DBM（骨髓组）、单纯DBM（DBM组）植入裸鼠皮下,应用免疫组化和RT-PCR方法,检测4、8、12、16w时组织块内成骨标志物I型胶原、整合素α2β1、骨钙素表达,及成骨特异性转录激活因子Cbfα1表达。结果:⑴PLL在材料内外表面形成均匀的乳白色涂层。PLL-DBM密度为（0.27±0.02）g/ml,孔隙率为（73±11）%,孔径为（412.73±160.29）μm。孔与孔之间有约100μm左右小孔贯通,孔隙内部有大量孔隙相互连通,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。⑵将富集材料及其不同浓度的材料浸提液分别与hMSCs共培养,形态学观察示细胞生长良好;细胞毒性实验显示hMSCs均良好增殖,毒性0-1级;流式细胞仪检测证实hMSCs、DOC均无DNA倍体异常的细胞,其CD29、CD105呈阳性,CD34、CD45呈阴性,材料浸提液不影响hMSCs表面分子的表达,且可通过促其向增殖期转化而促进hMSCs增殖;成骨诱导后DOC的生长与成骨活性无异常,可形成钙结节、表达I型胶原,ALP活性未受影响。溶血试验测得溶血率2.617%,符合生物材料要求小于5%的标准。⑶全身急性毒性试验显示裸鼠体重正常增长;致癌试验显示裸鼠正常存活,8月内未见肿块形成,心、肝、脑、肺、肾、脾组织学观察未见肿瘤细胞;皮下植入试验显示取材后皮下组织紧裹材料表面,色泽无改变,材料周围为一层薄纤维组织包绕,组织学观察发现皮下及皮肤组织细胞结构正常,无淋巴细胞/巨噬细胞浸润,未见细胞溶解和坏死迹象。⑷随着植入时间的延长,各复合材料植入组植入物的密度逐渐增高,在各时间点与单纯DBM组比较均有显著性差异;SCR组植入物密度与TEB组类似,显著高于骨髓组和DBM组。扫描电镜和组织学观察发现,随时间延长,组织块内PLL-DBM材料逐渐降解吸收,支架材料内逐渐形成小血管和新骨。8w时DBM开始降解,支架材料内有大量细胞和少数小血管形成,植入TEB内可见部分新生骨形成;12w时DBM支架部分降解,组织块内有较多的小血管长入,新骨亦明显增加;16w时植入区可见较为坚硬的骨性组织,并有血管长入。TEB组扫描电镜和组织学改变与SCR组类似,优于骨髓组和DBM组。⑸PLL-DBM的富集效果随PLL浓度增大而逐渐增加。0.1%PLL修饰的富集材料对人骨髓NCs浓度富集倍数为3.18±0.31倍、粘附率达53%±12%,对血小板富集倍数为3.88±0.68倍、粘附率达34%±10%,对骨髓干细胞即CFU-F的浓度富集倍数为5.25±1.40倍、粘附率达73%±13%、选择率达1.41±0.34。0.1%PLL修饰的富集材料与更高浓度PLL制备的PLL-DBM比较无明显差异,说明PLL-DBM对NCs的粘附具有一定的饱和性。富集后TEB中促成骨生长因子TGF-β1的浓度富集倍数为42.327±4.561,PDGF的浓度富集倍数为9.618±1.251,富集技术可以显著提高TEB中TGF-β1和PDGF含量。⑹随时间延长,植入区成骨标志物I型胶原、整合素α2β1和骨钙素的表达均逐渐增高,16w时达高峰,SCR组和TEB组表达相似,显著高于骨髓组和DBM组;免疫组化和RT-PCR法显示成骨早期SCR组Cbfα1 mRNA和蛋白表达显著增加,随着骨组织的逐渐成熟,Cbfα1的表达逐渐下降,16w时表达明显减弱。SCR组Cbfα1的表达与TEB组类似,优于骨髓组和DBM组。结论:⑴制备的PLL-DBM具有自体骨三维空间结构和促进细胞粘附的PLL,具有良好的细胞相容性、组织相容性和可降解性,能促进hMSCs的粘附与增殖,对DOC的成骨活性无影响,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。⑵SCR技术快速制备的TEB植入体内后能够成骨,并可以达到与体外培养的hMSCs复合制备的TEB同样的成骨效果。⑶PLL-DBM能明显增高骨髓有核细胞、血小板和CFU-F的浓度富集倍数和粘附率,显著提高TEB中TGF-β1和PDGF含量;推测SCR技术快速构建TEB后局部高浓度的骨髓干细胞和促成骨生长因子TGF-β1与PDGF,可能是SCR技术构建的TEB高成骨活性的可能机制之一。⑷SCR技术快速构建的TEB,通过在早期促进成骨特异性转录激活因子Cbfα1表达、中晚期上调成骨标志物I型胶原、整合素α2β1和骨钙素表达而促进成骨,可能是SCR技术构建的TEB高成骨活性的可能分子机制之一。
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