白粉菌诱导的中国野生葡萄cDNA文库中抗病基因的筛选

论文摘要

在前期的研究中,实验室以多年鉴定为高抗白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1为材料,采用Clontech SMART试剂盒构建了cDNA文库。在此基础上,采用抗病基因同源序列法进行克隆与分析,取得的主要研究结果如下:1.根据噬菌体在寄主大肠杆菌中能利用重组酶自身环化成质粒这一原理,将cDNA文库中的噬菌体环化成质粒,形成质粒文库。通过cDNA文库梯度稀释试验,确立了E.coli BM25.8与cDNA原始文库的最佳混合比例为200μL感受态BM25.8应与小于≤104 pfu的文库混合,才可获得分离良好且菌落数量满足筛选要求的环化cDNA文库。2.根据抗病基因蛋白质N、L6、RPS2上的位于P-环（P-Loop）上的GVGKTT氨基酸保守结构域设计简并PCR引物,对环化cDNA文库中的菌落进行PCR筛选,对阳性菌落的质粒进一步提取质粒进行PCR检测,最后对阳性质粒测序,获得了抗病相关cDNA片段36个。3.用Blast软件对葡萄植物36个抗病基因同源类似物（RGA）核苷酸序列进行分析,发现测得的序列中,大多数为未知基因序列,利用DNAstar软件中的ClustalW程序进行多序列比对,将所有序列分为2大类:一类是抗性相关基因,有些与已登陆葡萄抗白粉病基因序列相似,有些与水分胁迫表达基因相似,有些和葡萄抗皮尔斯病基因高度同源;另一类是与果实发育有关的基因,包括07-No.239、No.80、No.235、No.160、No.100、No.76、No.391、No.190、No.241、No.155、No.178、No.238。其中抗性相关基因根据功能是否已知分为已知功能抗性基因和功能未知的抗性基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄白粉病的研究进展
• 1.1.1 葡萄白粉病的特征及发病条件
• 1.1.2 葡萄属植物对白粉病的抗性遗传研究进展
• 1.1.3 葡萄属植物对白粉病抗性的分子生物学研究进展
• 1.2 植物抗病的分子生物学研究
• 1.2.1 植物抗病基因的类型、结构与功能
• 1.2.2 植物抗病基因克隆的方法
• 1.3 抗病基因同源类似物（RGA）的研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 白粉菌诱导的中国野生葡萄cDNA 文库的扩增
• 2.2.2 文库筛选的引物设计
• 2.2.3 白粉菌诱导的中国野生葡萄cDNA 文库的环化
• 2.2.4 葡萄环化cDNA 文库中阳性菌落的PCR 筛选
• 2.2.5 中国野生葡萄环化cDNA 文库中阳性菌落的培养
• 2.2.6 中国野生葡萄环化cDNA 文库中阳性菌落的质粒PCR 鉴定和测序
• 2.2.7 核酸序列的生物学分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 白粉菌诱导的中国野生葡萄CDNA 文库的扩增和文库环化
• 3.2 中国野生葡萄环化CDNA 文库的PCR 筛选
• 3.2.1 中国野生葡萄环化文库的阳性菌落PCR 筛选
• 3.2.2 中国野生葡萄环化cDNA 文库阳性菌落的质粒PCR 鉴定
• 3.3 中国野生葡萄环化CDNA 文库中阳性质粒的测序结果和序列分析
• 3.3.1 中国野生葡萄环化cDNA 文库中阳性质粒的测序结果
• 3.3.2 中国野生葡萄环化cDNA 文库中阳性质粒的序列分析
• 第四章 讨论
• 4.1 文库筛选方法的研究
• 4.2 抗病相关基因的序列特征
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介