松材线虫SCAR标记与分子检测技术

论文题目: 松材线虫SCAR标记与分子检测技术

论文类型: 博士论文

论文专业: 森林保护学

作者: 陈凤毛

导师: 叶建仁,汤坚

关键词: 松材线虫,拟松材线虫,特异片段,标记,核糖体基因,限制性片段长度多态性,试剂盒,检测

文献来源: 南京林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 针对松材线虫形态鉴定存在的不足,本文开展了以下四个方面的研究工作:(1)松材线虫与拟松材线虫的RAPD 检测技术的研究;(2)松材线虫与拟松材线虫的SCAR 分子标记;(3)松材线虫与拟松材线虫核糖体基因(rDNA)限制性片断长度多态性研究;(4)松材线虫快速检测试剂盒的构建。实验所用线虫样本共35 个。其中19 个松材线虫株系分别来自于美国、加拿大、中国、日本,13 个拟松材线虫株系分别来自日本、韩国、中国以及中国台湾地区,3 个线虫未定种分离自我国主要松林分布区的枯死松树。实验取得如下研究结果: 1、大量线虫基因组DNA 的提取采用裂解法直接提取,不需要研磨,减少DNA 的损失。所提取的DNA 质量较好,OD260/OD280 值在1.7-1.9 之间,样本DNA 含量在300-630 微克/毫升。少量线虫采用切割法提取,线虫经液氮处理10min 或-70℃处理15min 或-20℃处理40min,均能够扩增出谱带。2、通过RAPD 技术,从140 个随机引物中筛选出7 个特异性随机引物OPC08、OPC18、OPC19、OPK09、OPM05、OPN09 和OPY01,共扩增出12 个特异片段,其中7 个松材线虫特异片段,5 个拟松材线虫特异片段(。1)引物OPC08、OPK09 为松材线虫株系特异引物,OPC08 扩增特异片段长约760bp;OPK09 扩增出两条特异片段长度分别为1200bp、2400bp 左右。(2)引物OPN09、OPM05、OPY01 为松材线虫株系与拟松材线虫株系共有的特异引物。OPN09 扩增出两条松材线虫特异片段分别为480bp、880bp 左右,扩增出一条拟松材线虫特异片段长约620bp;OPM05 扩增松材线虫特异片段长约2100bp,扩增拟松材线虫特异片段长约1300bp;OPY01 扩增松材线虫特异片段长约730bp,扩增拟松材线虫特异片段长约850bp。(3)引物OPC18、OPC19 为拟松材线虫株系特异引物,OPC18 扩增特异片段长约970bp,OPC19 扩增特异片段长约1350bp。实验表明,这些随机引物具有特异性强、灵敏度高的优点。七个引物均可以区分松材线虫和拟松材线虫。3 、将松材线虫与拟松材线虫RAPD 特异片段①OPC19-M1350 、②OPK09-X2400、③OPC18 -M970、④OPM05-X2100、⑤OPN09-X480、⑥OPM05-M1300、⑦OPK09-X1200、⑧OPY01-M850、⑨OPY01-X730 进行分离、回收、与载体pGEM?-T Vector 连接,转化大肠杆菌、培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物。9 个特异随机片段中,有4 个成功转化为SCAR 标记。其中( 1)OPK09-X1200 通过引物对K09F1/R 可转化为SCAR-K09-X837,通过引物对K09F2/R可转化为SCAR-K09-X340,均为松材线虫SCAR 标记;(2)OPM05-X2100 通过引物对M05F1/R1 可转化为SCAR-M05-X1127,通过引物对M05F2/R1 可转化为

论文目录:

摘要

前言

第一章 文献综述

1.1 线虫的分布与危害

1.1.1 针叶树内伞滑刃线虫的种类

1.1.2 我国松属树种内线虫的种类

1.1.3 松材线虫的分布与危害

1.2 松材线虫与拟松材线虫的致病性差异

1.2.1 松材线虫的致病性

1.2.2 拟松材线虫的致病性

1.3 松材线虫遗传标记

1.3.1 形态学标记(Morphological Marker)

1.3.1.1 形态学标记方法

1.3.1.2 线虫形态学标记

1.3.1.3 伞滑刃属线虫形态鉴定

1.3.2 细胞学标记(Cytological Marker)

1.3.3 生化标记(Biochemical Marker)

1.3.3.1 蛋白质电泳分析

1.3.3.2 同工酶电泳技术

1.3.3.3 血清学方法

1.3.4 分子标记(Molecular Marker)

1.3.4.1 限制性片段长度多态性(RFLP)

1.3.4.2 任意扩增多带谱(MAAP)

1.3.4.3 DNA 指纹--微卫星DNA(SSR)

1.3.4.4 扩增片段长度多态性(AFLP)

1.3.4.5 分子杂交(Molecular Hybrization)

1.4 松材线虫病鉴定

1.4.1 林间枯死木诊断

1.4.2 林间活立木早期诊断

1.4.2.1 流胶法

1.4.2.2 化学法

1.4.3 原木诊断

1.4.3.1 直接观察和检验

1.4.3.2 显色反应

1.4.4 松树制品诊断

参考文献

第二章 松材线虫RAPD 检测技术

2.1 材料与方法

2.1.1 线虫来源

2.1.2 线虫的纯化与培养

2.1.3 线虫的收集

2.1.4 基因组DNA 的提取

2.1.4.1 溶液配制

2.1.4.2 大量DNA 提取

2.1.4.3 少量线虫DNA 提取

2.1.5 RAPD扩增

2.1.5.1 RAPD引物筛选

2.1.5.2 RAPD反应扩增体系

2.1.5.3 RAPD反应程序

2.1.5.4 RAPD结果检测

2.2 结果与分析

2.2.1 线虫基因组DNA 的提取

2.2.2 少量线虫DNA 提取

2.2.3 特异片段筛选

2.2.3.1 引物OPC_18

2.2.3.2 引物OPC_08

2.2.3.3 引物OPC_19

2.2.3.4 引物OPK_09

2.2.3.5 引物OPN_09

2.2.3.6 引物OPM_05

2.2.3.7 引物OPY_01

2.2.4 松材线虫RAPD检测

2.3 结论与讨论

参考文献

第三章 松材线虫SCAR 分子标记

3.1 材料与方法

3.1.1 供试松材线虫与拟松材线虫株系

3.1.2 特异RAPD片段

3.1.3 菌株与质粒

3.1.4 主要药品与试剂

3.1.4.1 试剂与药品配制

3.1.4.2 培养基配制

3.1.4.3 质粒提取液

3.1.5 特异RAPD片段的回收纯化

3.1.6 特异RAPD片段与载体连接

3.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.1.8 连接反应产物的转化

3.1.9 质粒DNA 的提取

3.1.10 插入片段的鉴定

3.1.11 测序

3.1.12 SCAR 引物的设计与合成

3.1.13 SCAR 标记的PCR 验证

3.2 结果与分析

3.2.1 特异RAPD的分离、回收纯化与克隆

3.2.2 特异片段序列

3.2.2.1 特异片段①OPC_19-M_1350

3.2.2.2 特异片段③OPC_18-M_950

3.2.2.3 特异片段④OPM_05-X_2100

3.2.2.4 特异片段⑥OPM_05-M_1300

3.2.2.5 特异片段⑦OPK_09-X_1200

3.2.2.6 特异片段⑧OPY_01-M_850

3.2.3 SCAR 标记的建立

3.2.3.1 OPC_18-M_950 片段转化

3.2.3.2 OPM_05-X_2100 片段转化

3.2.3.3 OPM_05-M_1300 片段转化

3.2.3.4 OPK_09-X_1200 片段转化

3.2.3.5 OPY_01-M_850 片段转化

3.3 结论与讨论

参考文献

第四章 松材线虫与拟松材线虫核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究

4.1 材料与方法

4.1.1 线虫株系与来源

4.1.2 线虫DNA 提取

4.1.3 ITS 区PCR 扩增

4.1.3.1 ITS-PCR 引物

4.1.3.2 ITS-PCR 反应体系

4.1.3.3 ITS-PCR 反应程序

4.1.4 RFLP 分析

4.1.4.1 限制性内切酶种类的选择

4.1.4.2 RFLP 反应体系

4.1.4.3 RFLP 反应条件

4.2 结果与分析

4.2.1 松材线虫与拟松材线虫rDNA-ITS 区PCR 扩增结果

4.2.2 RFLP 分析结果

4.2.2.1 Dra I 酶切结果

4.2.2.2 Apa I 酶切结果

4.2.2.3 Msp I 酶切结果

4.2.2.4 Sal I 酶切结果

4.2.2.5 Xho I 酶切结果

4.3 结论与讨论

参考文献

第五章 松材线虫快速检测试剂盒的构建

5.1 材料与方法

5.1.1 线虫来源

5.1.2 DNA 提取

5.1.3 PCR 扩增

5.1.3.1 引物

5.1.3.2 反应体系

5.1.3.3 反应程序

5.1.4 电泳检测

5.1.5 灵敏度检验

5.2 结果与分析

5.2.1 检测结果

5.2.2 灵敏度检验

5.2.3 试剂盒内容

5.3 结论与讨论

第六章 全文结论与展望

6.1 主要研究结论

6.2 展望

第七章 主要创新点

附录一:线虫形态图

附录二:部分测序图谱

详细摘要

发布时间: 2005-12-30

参考文献

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• [2].浙江松林生态系统对松材线虫入侵的抵御和恢复机制[D]. 石娟.北京林业大学2005
• [3].浙江松材线虫侵染后松林钻蛀性昆虫群落结构和功能[D]. 宋冀营.北京林业大学2007
• [4].黑松与松材线虫互作过程中细胞程序性死亡的研究[D]. 金钢.南京林业大学2007
• [5].松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）对温度胁迫适应的分子生态机制研究[D]. 戴素明.湖南农业大学2007
• [6].松墨天牛引诱剂和松材线虫分子检测技术研究[D]. 王焱.南京林业大学2008
• [7].松材线虫体表优势细菌的分离及定殖能力研究[D]. 贲爱玲.南京林业大学2010
• [8].自然感染松材线虫后黑松与马尾松的病理生理学研究[D]. 徐华潮.北京林业大学2013
• [9].接种松材线虫后抗性马尾松的防御物质变化及转录组分析[D]. 魏永成.中国林业科学研究院2016
• [10].基于3S技术的云南省松材线虫病风险评估研究[D]. 石雷.中国林业科学研究院2008

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• [3].松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）flp基因与香蕉穿孔线虫（Radopholus similes）Rs-eng-1基因的克隆和功能分析[D]. 肖罗.湖南农业大学2008
• [4].松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）在我国的潜在分布区研究[D]. 潘红伟.中国林业科学研究院2009
• [5].浙江松林生态系统对松材线虫入侵的抵御和恢复机制[D]. 石娟.北京林业大学2005
• [6].伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究[D]. 蒋立琴.浙江大学2006
• [7].浙江松材线虫侵染后松林钻蛀性昆虫群落结构和功能[D]. 宋冀营.北京林业大学2007
• [8].感染松材线虫病松树滑刃目线虫研究[D]. 黄任娥.南京林业大学2007
• [9].松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）对温度胁迫适应的分子生态机制研究[D]. 戴素明.湖南农业大学2007
• [10].松墨天牛引诱剂和松材线虫分子检测技术研究[D]. 王焱.南京林业大学2008

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