p73α和14-3-3σ抑制乳腺肿瘤生长的体内实验研究

论文摘要

目的:乳腺癌是严重威胁妇女健康的一种恶性肿瘤。据统计,全球每年约有120万140万妇女患乳腺癌,约有50万患者死于该病。研究表明,乳腺癌的发生、发展是多步骤、多基因作用的结果。随着乳腺癌发病率的不断增加,对其易感基因、相关基因及其产物的研究已成为肿瘤学关注的热点问题。研究发现,作为细胞周期负调控因子,14-3-3σ在人类乳腺癌细胞中的表达下降可能是乳腺癌发生的一个重要原因。研究已经证实,p53是14-3-3σ活化的主要调控因子。p73α是p73基因的剪切变异体,之前的体外实验已经证实,当p53基因缺失或突变时,p73α可以替代p53调节下游基因14-3-3σ,提高其抗肿瘤作用。但是至今,关于p73α和14-3-3σ抑制乳腺癌生长的体内实验研究尚未深入开展。本研究应用细胞外源基因转染和免疫缺陷鼠乳腺癌移植模型方法,进一步探讨了活体内p73α和14-3-3σ对乳腺癌生长的抑制作用,确认14-3-3σ的作用机制以及p73α基因对14-3-3σ的调节作用,为乳腺癌的早期发现和靶向治疗提供新的分子生物学指标和靶点。方法:1细胞培养和基因转染:将p53缺失型乳腺癌细胞系MDA-MB-231置于含10 %胎牛血清的DMEM培养液中培养,当细胞生长至约70 %融合时,用脂质体介导法分别转染pcDNA3-p53,pcDNA3-73α和pcDNA3-14-3-3σ质粒,按实验分组:对照组、p53组、p73α组、14-3-3σ组、p53+14-3-3σ组和p73α+14-3-3σ组,分别导入p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,以pcDNA3空质粒组为对照组。2乳腺癌裸鼠移植模型:选取BALB/C-null 3周龄雌性裸鼠12只,在无特定病原体（ specific pathogen free, SPF ）环境下饲养。分组同前,每组2只,其中标记鼠为a鼠,未标记鼠为b鼠。饲料喂养、2天,待裸鼠状态稳定后,按照分组,于a、b两裸鼠腋下分别接种MDA-MB-231, 2μg p53, 2μg p73α, 2μg 14-3-3σ, 2μg p53+2μg 14-3-3σ和2μg p73α+2μg 14-3-3σ（相当于4×106个细胞）。接种后48 h,b鼠尾静脉内按15 mg/Kg缓慢静注表阿霉素（ adriamycin,ADR ）[2],观察8周后脱颈椎处死裸鼠,计数腋下肿块数量、形态及大小,解剖乳腺组织取材,标本常规固定,石蜡包埋,4μm切片,HE染色,光镜观察。结果:1 MDA-MB-231乳腺癌细胞生长良好。2细胞外源性基因转染成功。将转染后的细胞提取总RNA进行RT-PCR,检测p53、p73α、14-3-3σ基因在转录水平上的表达。结果表明,（ 1 ） p53和p73α均可在转录水平上诱导14-3-3σ的表达,且14-3-3σ可反作用于p53,两者相互诱导;而14-3-3σ对p73α则无此作用。（ 2 ） p53可能参与了p73α对14-3-3σ的调节。3 12只裸鼠在实验全过程中无死亡。在裸鼠接种肿瘤细胞后第30天,发现对照组a鼠（未静注ADR者）皮下接种处可触及5 mm×5 mm肿物,质硬,表面不平,活动差;第40天发现14-3-3σ组a鼠皮下接种处可触及5 mm×3 mm肿物,质硬,活动可。至55天脱颈椎处死裸鼠,对照组a鼠肿瘤长至12 mm×7.2 mm,14-3-3σ组a鼠肿瘤长至7.2 mm×6.2 mm,所有组b鼠和其他组a鼠均未发现肿瘤生长。对裸鼠肿瘤进行形态学观察,肉眼观察:包膜多不完整,解剖肿瘤时有砂粒感,切面为黄白色。镜下观察:癌细胞呈实性团索,无腺腔样结构,细胞体积较小,呈条索状,周围有纤维化的癌性间质围绕,细胞异型性多见,常可见核分裂相,诊断为乳腺癌。结论:1在活体内,细胞周期负调控因子14-3-3σ存在活化和非活化两种状态,活化状态下的14-3-3σ可以发挥其抑制肿瘤生长的作用,而非活化状态的14-3-3σ无抑制肿瘤生长的作用。2 p53基因和p73α基因都是14-3-3σ主要的上游调控基因,当细胞DNA受到损伤时,他们不但可上调14-3-3σ的表达,而且可使其由非活化状态转为活化状态,发挥细胞周期负调控因子的作用,从而抑制肿瘤生长。3作为抑癌基因,p53基因和p73α基因可以多途径抑制裸鼠乳腺肿瘤细胞的生长,具体机制有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 p73α和14-3-3σ抑制乳腺肿瘤生长的体内实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 裸鼠模型在乳腺癌研究中的应用
• 致谢
• 个人简历