论文摘要
目的:应用体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,观察99Tc-MDP（锝99标记的亚甲基二瞵酸盐）及帕米膦酸二钠对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响及其作用差异,为99Tc-MDP治疗乳腺癌骨转移提供新的依据。方法:1细胞培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231复苏后,采用RPMI-1640培养基加入10%小牛血清和体积分数为青、链霉素各2×105 U·L-1,按常规细胞培养方法置37℃、5% CO2,饱和湿度的恒温孵箱中培养,细胞贴壁生长。待细胞长满瓶底约80%时,0.25%胰酶消化、传代。2实验分组将处于对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞株按相应的浓度加入培养瓶或96孔培养板于37℃、5%CO2含量,饱和湿度的孵育箱中培养24h后,设99Tc-MDP组、帕米膦酸二钠组和空白对照组。每组加入不同浓度（50、100、200μM）的99Tc-MDP、帕米膦酸二钠和空白对照组（培养基+质量分数0.9%NaCl）。3细胞生长曲线测定以5×103个/孔MDA-MB-231单细胞悬液接种于96孔培养板中,按实验分组加入试剂,每组设3个复孔,每隔24h取3孔,连续取5d,消化计数,绘制生长曲线。4形态学观察倒置相差显微镜观察形态学上的变化。5细胞增殖抑制试验采用MTT法检测99Tc-MDP和帕米膦酸二钠对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制情况,测定其吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率=（1-A实验组/A对照组）×100%。6流式细胞术分析采用美国B.D公司FACS-420流式细胞仪检测99Tc-MDP和帕米膦酸二钠作用细胞48h后细胞凋亡、细胞周期及凋亡相关基因bcl-2与bax蛋白的表达。结果:1利用细胞计数绘制细胞生长曲线,示经99Tc-MDP及帕米膦酸二钠处理后MDA-MB-231存活细胞数量明显减少,经99Tc-MDP处理的MDA-MB-231存活细胞数量与帕米膦酸二钠处理的MDA-MB-231存活细胞数量相比前者减少更明显。2采用MTT法测定细胞增殖抑制率,示经99Tc-MDP及帕米膦酸二钠处理后MDA-MB-231细胞生长缓慢,出现明显的生长抑制,并呈浓度和时间依赖性。经99Tc-MDP处理后MDA-MB-231细胞生长抑制作用较帕米膦酸二钠处理后MDA-MB-231细胞更明显。3形态学观察倒置相差显微镜观察,空白组细胞生长良好,细胞透明,密度较大,细胞呈梭形,胞浆内颗粒较少,细胞核隐约可见。99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组细胞密度明显减少,细胞颗粒较多,细胞间界限模糊,漂浮细胞数量增加,存活细胞显著减少。4细胞凋亡率变化,流式细胞仪检测示50μM剂量组99Tc-MDP及帕米膦酸二钠处理细胞后,凋亡率分别为9.59%和5.96%,而空白组细胞凋亡率为1.78%。随99Tc-MDP及帕米膦酸二钠浓度的增加,凋亡率增加,200μM剂量组99Tc-MDP及帕米膦酸二钠处理细胞后,凋亡率分别达到17.84%和17.13%,空白组细胞凋亡率变化不明显。99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组与空白组相比较,差异有显著性（P<0.05）,显示99Tc-MDP及帕米膦酸二钠均能诱导乳腺癌细胞凋亡。5细胞周期变化,细胞周期分析表明50μM99Tc-MDP组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为51.0%和39.5%,50μM帕米膦酸二钠组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为43.80%和50.70%,空白组分别为53.07%和34.80%,99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组与空白组相比较（P<0.05）。100μM 99Tc-MDP组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为36.70%和53.40%,100μM帕米膦酸二钠组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为34.0%和61.3%,99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组与空白组相比较（P<0.05）,99Tc-MDP组与帕米膦酸二钠组相比较（P<0.05）,分布百分率差异有显著性。200μM99Tc-MDP组细胞G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为36.6%和52.50%,200μM帕米膦酸二钠组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为37.40%和49.9%,99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组与空白组相比较（P<0.05）,分布百分率差异有显著性,99Tc-MDP组与帕米膦酸二钠组相比较（P>0.05）,无统计学意义。G2/M期细胞分布百分率则相反,即99Tc-MDP组与帕米膦酸二钠组细胞在此期内细胞分布百分率减少,空白组细胞分布百分率增多。6 Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达量流式细胞仪间接免疫荧光法检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白基因表达相对含量,99Tc-MDP组各浓度处理MDA-MB-231细胞2d后均使Bcl-2蛋白表达相对含量FI≤1.0（阴性表达）。200μM帕米膦酸二钠处理MDA-MB-231细胞2d后使Bcl-2蛋白表达相对含量FI≤1.0（阴性表达）,50μM和100μM帕米膦酸二钠处理MDA-MB-231细胞2d后使Bcl-2蛋白表达相对含量分别为1.27和1.18,随作用剂量增加,Bcl-2蛋白表达相对含量逐渐降低。99Tc-MDP组及帕米膦酸二钠组与空白组相比对Bax蛋白表达的相对含量调节无显著差异（P>0.05）。结论:在体外,99Tc-MDP和帕米膦酸二钠均能抑制MDA-MB-231细胞增殖及诱导MDA-MB-231细胞凋亡,并调控Bcl-2蛋白的表达;99Tc-MDP作用强于帕米膦酸二钠。