论文摘要
研究背景:淹溺是全球最重要的公共健康问题之一,是意外伤害致死的第二大原因。海水淹溺不仅是海上生产作业、航海事故的主要死亡原因,更是军队在海上作战、训练等非战斗减员的重要原因。海水淹溺后,除因喉头、气管反射性痉挛引起患者急性窒息外,引起死亡的主要原因是海水淹溺性肺水肿（pulmonary edema of seawater drowning,PE-SWD）,若得不到及时有效的救治,则可能进展为海水型呼吸窘迫综合征（seawater respiratory distress syndrome,SW-RDS）,死亡率较高。因此有效治疗PE-SWD及其引起的损伤是成功救治淹溺患者的关键。有研究表明,肺泡上皮细胞钠-钾ATP酶（Na+/K+-adenosine triphosphatase,NKA）在促进肺泡内液体的吸收中发挥着重要作用。因此上调NKA活性对促进肺水肿液的吸收,改善PE-SWD的预后至关重要。丹参酮IIA磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulphonate,STS）是丹参酮IIA的衍生物,在丹参中含量最多。STS具有多种药理作用,已广泛用于心脑血管疾病的治疗,还具有抗炎及抗氧化的作用。亦有文献报道STS在脂多糖引起的急性肺损伤中可减轻肺水肿及改善缺氧,但有关其在PE-SWD中的作用尚缺乏研究。本实验通过复制大鼠PE-SWD模型来观察STS对PE-SWD的治疗作用及对NKA的影响,并通过细胞实验进一步探讨STS发挥作用的可能机制,为临床应用提供实验依据。目的:通过建立大鼠PE-SWD模型及培养A549细胞,探讨STS在减轻PE-SWD中的作用,和其对NKA的影响,并通过细胞实验研究了ERK信号通路在STS调节NKA中的潜在机制。方法:动物实验1、实验分组及模型的制备:将48只大鼠随机分为正常组（normal group）、STS组（STS group）、海水组（SW group）、海水+STS组（SW+STS grouop）,每组12只。气管内滴入4ml/kg海水以建立大鼠PE-SWD模型,在海水灌注后立即腹腔内注射25mg/kgSTS。2、观察指标:1)PaO2:通过血气分析检测各组海水灌注前、海水灌注后30 min、1h、2h、4h、6h的PaO2。2)肺组织病理学:造模4小时后,观察各组肺组织病理学改变。3)肺水肿指数检测:海水灌注4小时后,测定肺湿/干重比值（W /D）和肺毛细血管通透性（PMVP）。4)NKA的表达及活性:利用试剂盒检测各组肺组织匀浆中NKA活性,采用Western blot检测NKAα1、β1亚基蛋白表达,并用RT-PCR方法检测NKAα1、β1mRNA水平。细胞实验1、实验分组及细胞的处理:将A549细胞随机分为正常组（normalgroup）、STS组（STS group）、海水组（SW group）、海水+STS组（SW+STS grouop）、海水+STS+ERK抑制剂（U0126）组（SW+STS+U0126 grouop）。海水（海水:培养液=1:4）刺激细胞4h,在加入海水后立即加入25ug/mlSTS, U0126在加入STS前30min作用于细胞。2、观察指标:1)NKA的表达及活性:利用试剂盒检测各组细胞的NKA活性,采用Western blot检测各组NKAα1、β1亚基。2)ERK1/2的表达:采用Western blot检测各组ERK1/2蛋白的表达。结果:动物实验1、PaO2:PE-SWD模型建立后30min,PaO2即降低到最低点,后缓慢升高,但低氧仍明显,STS治疗组从海水灌注后2h开始PaO2显著高于海水组（P < 0.05）,到4h时PaO2值增高达高峰（P < 0.01）,表明STS可改善海水灌注导致的缺氧。2、病理学改变:海水组的肺组织出血、水肿,肺泡间隔明显增厚、断裂及炎性细胞渗入肺泡腔,而STS治疗组肺损伤病理学结果较海水组明显减轻,表明STS可减轻海水灌注导致的肺组织损伤。3、肺水肿指标:海水吸入导致肺W/D、PMVP增加,而STS治疗组较海水组的W/D、PMVP明显下降（P < 0.05）,表明STS可减轻海水引起的肺水肿。4、肺组织中NKA表达及活性:海水吸入后肺组织的NKA活性及NKAα1、β1亚基蛋白表达及mRNA水平均明显下降,而STS治疗组的NKAα1、β1亚基蛋白表达及NKA活性均较海水组明显增加（P < 0.05）。而在mRNA水平上,STS组的NKAβ1亚基的mRNA显著增加（P < 0.05）,但NKAα1亚基的mRNA却与海水组无明显变化。细胞实验1、A549细胞的NKA表达及活性:海水浸泡A549细胞后,细胞的NKAα1、β1亚基蛋白表达、NKA活性均显著降低,而STS治疗组使上述指标均有所增高（P < 0.05）（这与大体实验的结果基本一致）,但加入了ERK抑制剂（U0126）后,NKAα1、β1亚基蛋白表达、NKA活性均较STS治疗组明显降低,表明STS对NKA的上调作用可部分被ERK抑制剂所阻断。2、A549细胞的ERK1/2表达:海水使细胞的ERK1/2蛋白表达降低,而STS治疗组增加了ERK1/2蛋白的表达,表明STS可刺激ERK1/2蛋白的表达。结论:1、在鼠PE-SWD中,STS可改善缺氧、减轻肺水肿及肺组织损伤。2、大体实验和细胞实验中,STS可通过上调NKA的表达及活性,从而促进肺泡内液体的吸收,以减轻肺水肿。3、在细胞实验中,STS可刺激ERK1/2蛋白的表达,而ERK1/2抑制剂可部分阻断STS对NKA活性的上调,表明STS可通过刺激ERK1/2信号通路来上调NKA的表达及活性。