产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性及相关耐药机制

论文摘要

目的:了解安徽省产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药情况,揭示其相关耐药机制,指导临床合理用药。研究新型质粒介导AmpC酶的分子生物学特性。材料与方法:安徽省细菌耐药性监控中心收集2005年随机月份35所医院住院和门诊患者的各种临床送检标本,无重复分离的大肠埃希菌共402株。采用MH琼脂倍比稀释法对野生菌进行12种抗菌药物的药物敏感试验。经头孢西丁表型试验进行初步筛选,对初筛阳性及可疑阳性的细菌,采用三维试验筛选高产AmpC酶株。对所有菌株通过多重PCR扩增质粒介导ampC基因。对产质粒介导AmpC酶菌株用PCR方法检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因、1类整合子基因盒插入序列和主动外排系统acrAB-tolC基因,以揭示其是否存在多种耐药机制。将多重PCR阳性的菌株行转移接合试验,并行全编码引物PCR扩增。对多次测序并经GenBank比对后确定的产新酶菌株进行以下实验:PCR扩增野生株和/或转移接合子中的AmpC型β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pUC-118载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,再次测定核苷酸序列,结果至GenBank比对,进行DNA序列分析。将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398,转化于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂倍比稀释法对野生株、接合子与转化株同时进行MIC测定。采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取,等电聚焦电泳测定其等电点（pI）。对粗酶纯化后,SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小,进行酶促反应动力学研究,以初步了解新酶的动力学特性。采用Southern Blotting试验再次验证新酶是否由质粒介导并定位其编码基因所在质粒大小。结果:检出产质粒介导AmpC酶菌株28株（7.0%）。产酶菌株对12种常用抗菌药物,除亚胺培南、美罗培南全部敏感外,对其他大多数抗菌药物耐药率均高于非产酶株。28株产酶菌株中有23株表现为多重耐药,20株检测出各型ESBLs基因,21株扩增出1类整合子基因盒插入序列,20株主动外排系统acrAB-tolC基因阳性。对402株大肠埃希菌用多重PCR检测质粒介导ampC基因,有28株阳性,再分别用单对引物对阳性株进行PCR扩增,结果显示:CIT阳性11株,EBC阳性7株,DHA阳性7株,ACC阳性2株,MOX阳性1株。对28株产酶菌PCR产物的测序结果进行BLAST分析,发现有两株为新的质粒ampC基因型,其基因序列均己提交GenBank,获得的登录号分别为:EF054895,EF417572,其中一株所产新酶经Jacoby GA同意并命名为MIR-4。产新型质粒介导AmpC酶菌株的转移接合试验和克隆表达试验均取得成功,其野生株、接合子及转化株的MIC结果显示:野生株和接合子有着几乎相同的耐药谱,而转化株对部分药物的敏感性较前两者明显下降。产新型质粒介导AmpC酶细菌转化株的等电聚焦及SDS-PAGE结果显示,其等电点在8.2左右,蛋白质分子量约为35kDa。Southern Blotting试验再次证实了新酶由质粒介导并定位其编码基因位于54Kb的质粒。酶促反应动力学研究,初步了解新酶对5种常用抗菌药物的Km值和Vmax值,结果显示:该酶对头孢他啶的水解效率最低.结论:本地区产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的耐药率均较高,多重耐药现象普遍,同时存在多种耐药机制,其中以产生灭活酶和1类整合子介导的耐药机制为主。对产酶株临床经验用药可选用碳青霉烯类、阿米卡星、四代头孢菌素类抗菌药物。本地区质粒介导AmpC酶以CIT,EBC,DHA型为主。经对编码基因比对分析后鉴定其中两株为新型质粒介导AmpC酶,均是首次在安徽省被发现。产新酶菌株存在多种耐药机制,且可通过质粒在不同菌株之间传递,因此有必要加强本地区产质粒介导AmpC酶菌株的监测并同其他地区进行耐药资料的交换,以形成大的耐药监测网,这些工作对于阻止耐药基因的传播有重要的流行病学意义。

论文目录

• 一.缩略词表
• 二.摘要（产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性及相关耐药机制）
• 中文摘要
• 英文摘要
• 三.第一部分正文（产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性及相关耐药机制）
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 四.第二部分正文（新型质粒介导AmpC酶分子生物学特性）
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五.附录
• 个人简历
• 发表论文
• 在读期间获荣誉及参加学术交流情况
• 致谢
• 综述
• 参考文献