Beta-连环蛋白与人卵巢癌细胞顺铂耐药相关性及其耐药逆转的研究

论文摘要

卵巢癌是女性生殖器常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于宫颈癌,而死亡率却位居第一位。由于起病隐匿、早期不易发现、易转移、预后差等特点,卵巢上皮癌的治疗效果一直未能得到根本改善,使得卵巢癌患者5年生存率一直徘徊在30%40%左右。近年来,手术结合放化疗的综合方案成为卵巢癌治疗的主要手段。卵巢癌对铂类化疗药物的敏感性降低是导致卵巢癌复发、转移及死亡率增加的重要因素。因此,探讨卵巢癌耐药产生的相关机制、寻找新的分子靶点或有效的耐药逆转剂,为肿瘤基因治疗提供新思路具有十分重要的临床意义。经典Wnt信号传导通路对于细胞信号的转导起重要的调节作用。而β-连环蛋白（β-catenin,β-cat）是Wnt信号通路的关键调控分子,在细胞黏附,生长分化,损伤修复,肿瘤的发生、转移中起重要作用。β-连环素（β-catenin,β-cat）作为一种重要的粘附分子,参与细胞间的粘附及Wnt信号通路的传导。Wnt通路中各成员功能的改变可导致β-catenin的变化,β-catenin稳定入核启动下游原癌基因的表达,在多种恶性肿瘤的发生,发展和预后中都有重要意义。目前,有证据表明β-catenin与肿瘤耐药的产生具有一定的相关性。一方面胞内β-catenin表达升高,入核启动DNA结合蛋白家族的T细胞因子/淋巴细胞增强因子（Tcf/Lef）活性,激活下游靶基因如MDR1、c-myc、MRP2、cyclinD1等,从而影响肿瘤细胞对药物的敏感性。一方面,β-catenin参与细胞内分子间的信号转导途径,通过改变细胞的生长和凋亡情况进而影响肿瘤对化疗药物的敏感性。因此,我们相信,β-catenin是一个有潜力的肿瘤分子治疗靶点。为了验证β-catenin在卵巢癌铂类耐药产生中的作用,本研究应用免疫细胞化学技术、western blot等检测卵巢癌顺铂敏感株A2780细胞、顺铂耐药株CP70细胞中β-catenin的表达,分析与卵巢癌铂类耐药之间的关系;应用siRNA技术抑制细胞中β-catenin表达后,观察卵巢癌细胞对顺铂化疗敏感性的变化。探讨β-catenin与卵巢癌细胞耐药的机制,为逆转卵巢癌铂类耐药的进一步研究提供有价值的实验依据。【研究目的】1.探讨β-catenin基因与卵巢癌铂类耐药的相关性;2.探讨顺铂对卵巢癌细胞中β-catenin表达的影响;3.探讨β-catenin基因沉默对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。【研究方法】1.免疫细胞化学法、免疫荧光检测卵巢癌顺铂敏感株A2780细胞、顺铂耐药株CP70细胞中β-catenin蛋白表达及定位情况;2. western blot检测卵巢癌顺铂敏感株A2780细胞、顺铂耐药株CP70细胞中β-catenin蛋白表达情况;3. MTT法检测卵巢癌顺铂敏感株A2780细胞、顺铂耐药株CP70细胞对顺铂的敏感性;4. western blot检测不同顺铂处理后,A2780和CP70细胞中β-catenin蛋白表达水平的变化;5.β-catenin siRNA瞬时转染顺铂耐药细胞CP70,real-time PCR检测干扰后细胞内β-catenin的mRNA水平以及western blot检测干扰后蛋白抑制水平;6.免疫细胞化学法、免疫荧光法检测β-catenin siRNA瞬时转染顺铂耐药细胞CP70后细胞内β-catenin蛋白表达水平;7. MTT法检测β-catenin siRNA转染后,CP70细胞对顺铂化疗敏感性的改变;8. TUNNEL法检测β-catenin siRNA转染后顺铂诱导的CP70细胞的凋亡情况。【研究结果】1.β-catenin蛋白在顺铂敏感细胞株和耐药细胞株中均呈现出核浆共表达,但存在表达差异。在A2780中,以浆表达为主,可见核表达,而CP70中则见核浆均表达较高;2.顺铂耐药细胞株CP70中β-catenin蛋白表达水平高于顺铂敏感株A2780,两者间有统计学差异（P<0.05）;3. MTT检测顺铂对两种细胞的生长抑制率,顺铂对耐药细胞CP70和敏感细胞A2780的半数抑制浓度分别为14.3μM和74.0μM,耐药指数为5.17;4.给予不同剂量的顺铂诱导48h,敏感细胞A2780中β-catenin蛋白表达呈剂量依赖性降低;而在耐药细胞株CP70中,随顺铂剂量增大β-catenin表达先增高后降低,于20μM时β-catenin表达较高,继续增加至40μM时β-catenin表达逐渐降低;5.β-catenin siRNA瞬时转染48h后,卵巢癌顺铂耐药细胞CP70中β-cateninmRNA水平明显降低,western blot提示β-catenin蛋白表达抑制较为明显（P<0.05）;6.免疫细胞化学和免疫荧光结果提示β-catenin siRNA干扰后细胞内β-catenin表达量降低,染色变淡和荧光强度变弱;7.β-catenin siRNA转染耐药细胞CP70后,CP70的对顺铂敏感性发生了改变。顺铂对细胞的半数抑制浓度（IC50）由转染前的74.0μM降至转染后的24.59μM,耐药逆转倍数3.01（P<0.05）;8.β-catenin siRNA转染后,顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡明显增多,转染组的细胞凋亡指数为（43.1±4.2）%,为单用顺铂组的2.14倍,两者有统计学差异（P<0.01）。【结论】1.β-catenin在顺铂敏感细胞和耐药细胞中蛋白表达特点不同。在耐药细胞株CP70中β-catenin蛋白表达较敏感株A2780表达水平高。提示β-catenin表达水平和亚细胞定位与卵巢癌顺铂耐药有关。2.耐药细胞CP70和敏感细胞A2780两种细胞内β-catenin蛋白表达量随顺铂剂量增加出现不同的变化趋势。提示β-catenin在卵巢癌顺铂耐药形成机制中发挥重要作用。3.抑制β-catenin蛋白表达能在一定程度上促进细胞凋亡和增强卵巢癌细胞对顺铂化疗的敏感性,其机制可能与凋亡调控有关。β-catenin可能成为逆转卵巢癌铂类耐药的有效靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、卵巢癌铂类耐药的机制的研究进展
• 二、Wnt/β-catenin 通路的研究进展
• 第一部分 Beta-catenin 与卵巢癌细胞顺铂耐药性的相关性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 SiRNA 干扰耐药细胞株CP70 中beta-catenin 表达对其耐药性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢