草地早熟禾原生质体的培养及影响其分裂生长的生理因素分析

论文摘要

草地早熟禾（Poa Pratensis L.）属冷季型草坪草,是温带地区主要的建坪草种和优良的草坪草种质资源之一。由于草地早熟禾兼性无融合生殖特性,利用常规的育种方法培育新品种受到了很大的限制。植物体细胞杂交技术的产生和发展为草地早熟禾新品种选育提供了一条新途径,良好的原生质体培养体系是利用体细胞杂交技术进行品种改良的根本和制约点。本研究在前期研究基础上以3个草地早熟禾品种（午夜2号、新格莱德和橄榄球2号）为材料,进一步研究了草地早熟禾植株再生的影响因素、原生质体培养程序和相关的技术环节,探索了草地早熟禾原生质体供体材料的生理特性与原生质体分裂再生能力之间的关系。1.以草地早熟禾品种午夜2号、新格莱德和橄榄球2号成熟种子为外植体,进行了其愈伤组织诱导和生长的研究,重点针对午夜2号和新格莱德愈伤组织在培养过程中出现的水渍化和褐变现象进行了培养条件的调整,具体如下: （1）午夜2号愈伤组织在诱导培养初期最佳培养基为MS+1 mg·L-1 2,4-D+0.3 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂,pH 5.8;在第5次继代之后出现较多水渍化状况,调整培养基(MS+1 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂,pH 6.0)后愈伤组织的状态得到极大改善。（2）新格莱德诱导愈伤组织的最适培养基为:在第1-7次继代用基本MS培养基(含有30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+3 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA,pH 5.8),从第8次开始使用稍加改变部分成分的MS培养基(添加0.4 mg·L-1 6-BA,7.5 g·L-1琼脂,pH 6.0,其余同基本MS培养基)时能得到优质的愈伤组织。（3）橄榄球2号最适愈伤组织诱导培养基为:MS+3 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂,pH 5.8。2.以培养的草地早熟禾品种午夜2号、新格莱德和橄榄球2号的优质胚性愈伤组织为材料,用酶解法分离原生质体,进行了原生质体培养。着重研究了不同渗透剂和渗透压对草地早熟禾原生质体游离的影响、不同培养方式对草地早熟禾原生质体分裂生长的影响。结果表明:（1）采用继代培养8-10 d的午夜2号和橄榄球2号胚性愈伤组织,在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.3%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,以甘露醇作为渗透剂,其浓度为13%时可从午夜2号和橄榄球2号胚性愈伤组织中游离出优质多量的原生质体;甘露醇浓度为11%时新格莱德原生质体产量和活力最高。（2） 3个品种的原生质体在固液双层培养方式下的分裂频率均高于液体浅层培养时的分裂频率。午夜2号和橄榄球2号原生质体在pH 5.8时分裂率最高,为42.8%和29.4%,新格莱德原生质体在pH 6.0时原生质体的分裂率达到最大值,为50.1%。3.分别测定了继代培养期间草地早熟禾午夜2号、新格莱德和橄榄球2号原生质体供体材料的生理生化指标,探讨了这些指标与原生质体再生细胞分裂、生长的关系。结果表明:（1）在更换新鲜培养基后的第8-10 d,3个品种愈伤组织的可溶性蛋白质含量达到最高值。新格莱德和午夜2号愈伤组织之间其可溶性蛋白质含量相差不大,而橄榄球2号愈伤组织的可溶性蛋白质含量显著低于前两者。（2）测定了更换新鲜培养基后第8 d各品种愈伤组织的游离氨基酸总量、SOD和POX活性,发现新格莱德愈伤组织中游离氨基酸总量、SOD和POX活性均最高,橄榄球2号愈伤组织中上述三个测定值都低于其它两个品种。说明起始材料的生理状态与其原生质体再生力之间有一定的正相关性。

论文目录

• 项目来源
• 摘要
• Abstract
• 缩写词（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 草地早熟禾组织培养研究进展
• 1.2.1 草地早熟禾组织培养研究概况
• 1.2.2 草地早熟禾组织培养常见问题
• 1.2.2.1 菌类污染
• 1.2.2.2 材料褐变
• 1.2.2.3 材料水渍化
• 1.3 植物原生质体培养研究进展
• 1.3.1 植物原生质体的分离与纯化
• 1.3.1.1 原生质体基因型的选择
• 1.3.1.2 原生质体起始材料的选择
• 1.3.1.3 原生质体起始材料的预处理
• 1.3.1.4 原生质体的分离方法
• 1.3.1.5 原生质体的纯化
• 1.3.1.6 原生质体产量测定和活力鉴定
• 1.3.2 植物原生质体培养
• 1.3.2.1 原生质体培养基
• 1.3.2.2 原生质体培养方法
• 1.3.2.3 原生质体的发育与植株再生
• 1.4 植物原生质体生理生化状况的研究进展
• 1.4.1 可溶性蛋白质和总氨基酸含量
• 1.4.2 过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性
• 1.4.3 多胺
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 草地早熟禾愈伤组织的诱导培养及其影响因素的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器和试剂
• 2.2.4 实验设计和方法
• 2.2.4.1 三个草地早熟禾品种种子愈伤组织的诱导和培养
• 2.2.4.2 培养过程中愈伤组织水渍化和褐变状态的观察统计
• 2.2.4.3 影响愈伤组织水渍化和褐变的因素分析
• 2.2.4.3.1 继代培养代数和时间
• 2.2.4.3.2 6-BA 浓度
• 2.2.4.3.3 培养基的琼脂含量
• 2.2.4.3.4 pH 值
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 继代次数对3 个品种草地早熟禾愈伤组织状态的影响
• 2.3.2 激素水平对愈伤组织生长状态的影响
• 2.3.3 培养基pH 值和琼脂含量对愈伤组织生长状态的影响
• 2.3.4 最适培养条件的确定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 外源激素对愈伤组织状态的影响
• 2.4.2 琼脂和pH 值在植物组织培养中的作用
• 2.5 小结
• 第三章 草地早熟禾不同品种原生质体培养及其最适培养条件的确定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要仪器和试剂
• 3.2.3 方法
• 3.2.3.1 用于分离原生质体的愈伤组织的优化培养
• 3.2.3.2 原生质体的游离和纯化
• 3.2.3.3 原生质体的数量和活力观察与测定
• 3.2.3.3.1 原生质体的计数
• 3.2.3.3.2 原生质体的活性检测
• 3.2.3.4 原生质体培养
• 3.2.3.4.1 培养基
• 3.2.3.4.2 培养方式
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶液渗透剂和渗透压对草地早熟禾不同品种原生质体产量和活力的影响
• 3.3.1.1 午夜2 号
• 3.3.1.2 新格莱德和橄榄球2 号
• 3.3.2 不同培养方式及培养液pH 值对不同品种草地早熟禾原生质体分裂频率的影响..
• 3.3.3 不同基因型原生质体分裂生长的差别
• 3.4 讨论
• 3.4.1 渗透剂和渗透压对原生质体产量和品质的影响
• 3.4.2 不同培养方式对原生质体生长分裂的影响
• 3.4.3 基因型对原生质体分裂生长的影响
• 3.5 小结
• 第四章 影响草地早熟禾原生质体生长和分裂的生理因素分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 原生质体的分离和培养
• 4.2.2.2 生理生化指标的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 原生质体培养
• 4.3.2 可溶性蛋白质的含量
• 4.3.3 氨基酸含量
• 4.3.4 超氧物岐化酶（SOD）的活性
• 4.3.5 过氧化物酶（POX）活性
• 4.4 讨论
• 4.4.1 继代培养后草地早熟禾3 个品种愈伤组织内蛋白质含量的变化趋势
• 4.4.2 不同品种原生质体分裂和生长能力的比较
• 4.4.3 可溶性蛋白质含量与原生质体分裂的关系
• 4.4.4 氨基酸含量与原生质体分裂的关系
• 4.4.5 SOD 与POX 活性与原生质体分裂的关系
• 4.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介