熊果酸对大鼠肝星状细胞NOX亚基p47Phox及其调控的下游信号通路的影响

论文摘要

背景：肝纤维化是肝脏慢性损伤后的一种普遍现象,最终导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）在肝脏中过度沉积。瘦素是一个重要的促肝纤维化因子,它与HSC上的Ob受体结合后,引起Janus激酶（Janus kinase,JAK）磷酸化及JAK-信号转导及转录激活因子（signal transducers and activators of transcription factor, STAT）的活化。JAK还通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）产生活性氧簇（Reactive oxygen spicies, ROS）,以还原-氧化方式激活细胞内信号通路如细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）及蛋白激酶B（Protein kinase B, PKB,又称AKT）,使信号级联放大,导致与纤维生成及炎症有关的基因表达。我们前期体内研究发现熊果酸（Ursolic acid, UA）能明显改善肝纤维化大鼠的肝组织结构,效果优于秋水仙碱,体外实验发现UA能抑制HSC的增殖,并诱导其凋亡；UA干预后能显著抑制瘦素诱导的NOX亚基p22Phox和Rac1 mRNA的表达及ROS的产生,并能抑制核因子-κB （Nuclear factor-κB, NF-κB）激活,从而诱导HSC的凋亡。本研究将基于前期的研究结果,进一步观察UA对瘦素诱导的HSC NOX亚基p47Phox及下游信号通路ERK1/2的激活和Ⅰ型胶原表达的影响,探讨UA抗肝纤维化的分子机制。目的：探索UA对大鼠肝星状细胞（HSC-T6） NOX亚基p47Phox及其调控的下游信号通路ERK1/2激活的影响,以及对HSC增殖及分泌细胞外基质的影响,为UA应用于抗肝纤维化治疗提供理论依据。方法：将处于对数生长期的HSC-T6细胞分为6组：正常对照组;瘦素组（100ng/ml）;熊果酸（50μM）干预组（瘦素+熊果酸）；AG490（50μM）干预组（瘦素+AG490）；DPI（20μM）干预组（瘦素+DPI）; PD98059 （30μM）干预组（瘦素+PD98059）。在药物作用HSC-T6细胞30mmin后,提取膜蛋白和总蛋白,采用Western blotting分别检测p47Phox和p-ERK1/2的表达；药物作用12h后,提取总RNA,采用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原的表达；药物作用12h、24h及48h后,采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖情况。结果：1.熊果酸干预对瘦素诱导的NOX亚基p47phox蛋白膜移位的影响瘦素刺激HSC-T6细胞30min后,细胞膜p47phox蛋白的表达较正常对照组升高（P<0.01）；熊果酸干预后的细胞膜p47phox蛋白的表达明显低于瘦素组（P<0.01）,与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）;AG490干预组及DPI干预组细胞膜p47phox蛋白的表达均低于瘦素组（P<0.01）；PD98059干预组细胞膜p47phox蛋白的表达低于瘦素组（P<0.05）；熊果酸干预组、AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组间相比,细胞膜p47phox蛋白的表达差异无统计学意义（均P>0.05）。上述结果表明熊果酸能抑制瘦素诱导的p47phox向细胞膜移位。2.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞ERK1/2蛋白磷酸化的影响瘦素刺激HSC-T6细胞30min后,细胞内p-ERK1/2的表达较正常对照组升高（分别为P<0.01,P<0.05）；熊果酸干预后p-ERK1/2的表达明显低于瘦素组（P<0.01）,与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组p-ERK1/2的表达均低于瘦素组（分别为P<0.01,P<0.05）；熊果酸干预组、AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组间相比,p-ERK1/2表达的差异无统计学意义（均P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以降低瘦素介导的ERK1/2的磷酸化。3.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Ⅰ型胶原的mRNA表达较正常对照组升高（P<0.01）；熊果酸干预后Ⅰ型胶原的mRNA表达明显低于瘦素组（P<0.01）,与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组Ⅰ型胶原的mRNA表达均低于瘦素组（P<0.01）；熊果酸干预组、AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组间相比,Ⅰ型胶原的mRNA表达差异无统计学意义（均P>0.05）。上述结果表明熊果酸能下调瘦素介导的HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达。4.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖的影响瘦素刺激HSC-T6细胞12h后细胞增殖高于正常对照组；熊果酸干预12h后细胞增殖低于瘦素组（P<0.01）,但高于DPI干预组的表达（P<0.01）,与AG490干预组、PD98059组相比差异无统计学意义（P>0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞24h后细胞增殖高于正常对照组；熊果酸干预24h后细胞增殖低于瘦素组（P<0.01）,但高于AG490干预组、DPI干预组及PD98059干预组（P<0.01）；AG490干预组细胞增殖低于DPI干预组及PD98059干预组（P<0.01）；DPI干预组及PD98059干预组细胞增殖无统计学意义（P>0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞48h后细胞增殖高于正常对照组；熊果酸干预组48h后细胞增殖低于瘦素组（P<0.01）,但高于DPI干预组（P<0.01）,与AG490干预组及PD98059干预组无统计学意义（P>0.05）；DPI干预组48h后细胞增殖均低于熊果酸干预组、AG490干预组及PD98059干预组（P<0.01）；AG490干预组与PD98059干预组细胞增殖无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明瘦素可促进HSC-T6细胞的增殖,而熊果酸可以抑制其增殖。结论：1.瘦素能诱导HSC-T6细胞的NOX亚基p47phox蛋白向细胞膜移位,使NOX激活,同时诱导了ERK1/2的磷酸化；熊果酸干预能抑制瘦素诱导p47phox蛋白向细胞膜移位；同时抑制细胞内ERK1/2的磷酸化。2.熊果酸能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖及Ⅰ型胶原的mRNA表达,其机制可能与熊果酸抑制了NOX-ERK1/2信号网络激活有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 肝纤维化的研究现状
• 1.2 NADPH氧化酶在肝纤维化发病中的作用
• 1.3 熊果酸的生物学活性及抗肝纤维化的作用
• 1.4 本课题研究熊果酸抗肝纤维化的分子机制
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 主要液体的配制
• 2.2.2 肝星状细胞（HSC-T6）的培养
• 2.2.3 实验分组及药物处理
• phox蛋白的表达'>2.2.4 Western-blotting检测细胞膜p47^phox蛋白的表达
• 2.2.5 Western-blotting检测p-ERK1/2的表达
• 2.2.6 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Ⅰ型胶原mRNA的表达
• 2.2.7 四氮噻唑蓝（MTT）比色试验检测HSC-T6细胞的增殖
• 2.3 统计学处理
• 第3章 结果
• phox蛋白膜移位的影响'>3.1 熊果酸干预对瘦素诱导的NOX亚基p47^phox蛋白膜移位的影响
• 3.2 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞ERK1/2蛋白磷酸化的影响
• 3.3 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响
• 3.4 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 瘦素激活HSC及促肝纤维化的作用及机制
• 4.2 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞NOX激活的影响
• 4.3 熊果酸对NOX调控的ERK1/2信号通路的影响
• 4.4 熊果酸对HSC-T6细胞增殖及Ⅰ型胶原产生的影响
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述（1）
• 参考文献
• 综述（2）
• 参考文献