论文摘要
砷是一种有毒的两性金属,能以有机盐和无机盐的形式广泛分布于环境中。人类摄入过量的砷可以导致糖尿病和癌症等多种疾病。然而几乎所有微生物在进化过程中都形成了对砷的解毒系统。其中研究最为广泛的是原核微生物的抗砷系统。从澳大利亚砷污染土壤中分离出来的Bacillussp.CDB3菌株中含有一个拥有8个基因的抗砷操纵子ars1（arsRYCDATorf7orf8）,是迄今为止最长的抗砷操纵子中的一员。其中Orf7和orf8基因第一次被发现与已知抗砷基因位于同一个操纵子上。本研究在前期研究工作的基础上,主要通过对含有ars1的质粒pAR27上基因的单敲除和双敲除,砷敏感菌株E.coli AW3110的转化及抗砷实验,初步研究抗砷操纵子中arsA,arsD,arsT,orf7和orf8基因的功能。并对已知基因组原核微生物抗砷操纵子中的新抗砷基因进行了筛选和生物信息学分析。砷敏感菌株E.coli AW3110的抗砷实验结果表明,arsA基因是参与细菌抗砷反应的重要基因之一。arsA基因的突变会大大降低细菌抵御亚砷酸盐的能力。这表明Bacillus sp.CDB3ars1上的arsA基因产物可以与ArsY结合,形成ArsAY复合物,提高细菌对亚砷酸盐的抗性。将arsDA基因敲除质粒pWZ6转化到E.coli AW3110菌株中并进行抗砷实验,结果表明C末端两对半胱氨酸（Cys112,113和Cys119,120）对ArsD调节arsl转录起着关键的作用。Bacillus sp.CDB3的基因组测序结果表明,除了抗砷操纵子ars1上的arsT基因外还含有三个可能的硫氧还蛋白还原酶基因,然而只有ArsT完整保留了已知功能的硫氧还蛋白还原酶功能域。RT-PCR的实验结果证明arsl可以在异源宿主E.coli AW3110中转录产生一个包含8个基因的长转录子和一个包含3个基因的短转录子。表明orf7和orf8基因可以在异源宿主E.coli AW3110中转录表达。虽然抗砷实验的结果未能证明Orf7是一个与抗砷相关的基因,但是其参加抗砷反应的可能性不能被排除。orf8基因产物由141个氨基酸组成,该基因的突变仅影响宿主对砷酸盐的抗性,但对亚砷酸盐的抗性没有影响。转orf8基因E.coliJM109的抗砷实验结果表明新基因orf8可以提高异源宿主对砷的抗性。我们利用GeneBank中的数据库,从已知基因组原核微生物中筛选出577个可能的抗砷操纵子和242个与抗砷相关的新基因。其中,90个基因与已知基因具有序列同源性,152个基因无明显同源关系。生物信息学分析表明,其中75个基因被预测出可能参与的生化途径,分布到13个生物反应途径中。其中参与到细胞位置构成和生物反应调节的基因分别占29.3%和13.3%。在这90个基因中,有55个基因被分成8类分子功能,具有转移酶活性,水解酶活性和核苷酸结合活性的基因共占69%。除此之外,有6个基因在抗砷操纵子中高频出现（10次以上）,分别为major facilitator transporter（32）,putative permease（47）,redox active disulfide protein 2（42）,GCN5-like N-acetyltransferase（13）,glyoxalase/bleomycin resistance protein/dioxygenase（27）和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（10）。