点突变前体肽产生新型环噻唑霉素变种的研究

论文摘要

硫肽类抗生素是一类源于微生物,富含硫元素、结构被高度修饰的重要天然产物,对很多高抗药病原菌都有很强的抑制作用。尽管它们存在着整体上的结构差异,但是它们共同具有典型的结构特征:包括含多个半胱氨酸衍生的两个氨基酸残基间的异源环（包括噻唑和噻唑啉）、分子结构中心位置的6元含氮杂环（吡啶或者脱水哌啶环）。近年来,研究表明,硫肽类抗生素就是由基因组编码、核糖体合成后经由一系列的后修饰成熟释放的一类抑菌多肽。环噻唑霉素（cyclothiazomycin,CLT）是一种比较特别的硫肽类抗生素。自身有多处结构较为罕见,包括非2, 3-位噻唑取代的中心吡啶环,等数目的噻唑啉和噻唑以及一个叔碳上的硫醚键。2009年,环噻唑霉素生物合成基因簇被克隆,并且首次在链霉菌的模式菌株变铅青链霉菌Streptomyces lividans 1326中实现硫肽类抗生素的异源表达。其中,结构基因cltA编码产生环噻唑霉素前体,前体多肽再经由基因簇中的其他蛋白进行翻译后修饰,最终成熟并释放至胞外。本研究中我们利用点突变环噻唑霉素前体肽和异源表达的方法,突变了环噻唑霉素前体肽7个位点的氨基酸残基,得到了14个突变株和23个新型环噻唑霉素变种,其中,有6个突变株的产物对玉米小斑（Bipolaris maydis）的生长有抑制作用。我们希望通过此方法,不仅能获得更多地新型硫肽类抗生素,而且能通过氨基酸的突变揭示出环噻唑霉素生物合成机制以及生物活性机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 链霉菌的简介
• 1.2 硫肽类抗生素生物合成基因簇的研究进展
• 1.2.1 Cyclothiazomycin（CLT，环噻唑霉素）
• 1.2.2 Micrococcins
• 1.2.3 Thiocillins
• 1.2.4 Thiostrepton（硫链丝菌素，TSR）
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验中使用的菌株
• 2.1.2 实验中使用的质粒
• 2.1.3 实验中使用的引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 化学试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌质粒DNA 的提取
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA 的少量快速提取及其检测
• 2.2.3 链霉菌质粒DNA 的大量提取
• 2.2.4 链霉菌总DNA 的提取
• 2.2.5 沉淀DNA
• 2.2.6 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.7 DNA 片段的胶回收
• 2.2.8 大肠杆菌钙转法感受态细胞的制备及其外源DNA 转化
• 2.2.9 大肠杆菌电转法感受态细胞的制备及其外源DNA 转化
• 2.2.10 链霉菌培养及其菌种保藏[52]
• 2.2.11 质粒DNA 从大肠杆菌到链霉菌的两亲本跨属接合转移（适用于吸水链霉菌和其他链霉菌）
• 2.2.12 环噻唑霉素及本研究中新型抗生素的快速提取
• 2.2.13 利用HPLC-MS 对环噻唑霉素及本研究中新型抗生素进行检测分析
• 2.2.14 利用 LC-EI-Q-TOF 对环噻唑霉素及本研究中新型抗生素进行高精度质谱检测分析
• 2.2.15 DNA 序列分析
• 2.2.16 氨基酸序列分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 点突变环噻唑霉素前体肽获得环噻唑霉素变种的方法构建
• 3.2 获得的环噻唑霉素变种
• 3.2.1 产生一个化合物的突变株
• 3.2.2 产生多种化合物的突变株
• 3.2.3 没有产生化合物的突变株
• 3.3 点突变环噻唑霉素前体肽对环噻唑霉素生物合成途径的影响
• 3.4 环噻唑霉素变种生物活性的测试研究
• 3.5 点突变环噻唑霉素前体肽对环噻唑霉素生物活性的影响
• 第四章 总结与展望
• 4.1 点突变前体肽产生新型环噻唑霉素变种的研究的工作总结与创新点
• 4.2 研究工作的展望
• 参考文献
• 致谢
• 附件