Th17细胞参与调控哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的分子机制研究

论文摘要

支气管哮喘是多种炎性细胞参与的慢性气道炎症,T淋巴细胞在其中发挥着重要的免疫调节作用。Th2占优势的Th1/Th2失衡被认为是哮喘发病的一个重要的免疫学机制。Th2细胞分泌IL-4、IL-13、IL-5等细胞因子促进IgE的产生及嗜酸细胞的分化,从而导致了嗜酸细胞性哮喘的发病。但是我们课题组前期研究结果显示有49.37%的哮喘患儿为非嗜酸细胞性哮喘,其中又有半数以上的患儿气道为中性粒细胞性炎症。因此用Th1/Th2失衡理论不能完全解释这部分哮喘的发病机制。Th17细胞是一类新的CD4+T细胞亚群,能够特异性地产生细胞因子IL-17;并且具有特异性转录因子核孤儿受体γt （RORγt）,诱导Th17细胞的产生及分化。IL-17具有强大的招募中性粒细胞的作用。近来研究表明,Th17细胞可能与哮喘相关。我们假设不同的哮喘亚型存在不同的免疫学机制:Th2细胞介导了嗜酸细胞性哮喘气道炎症的发生,Th17细胞则介导了中性粒细胞性哮喘气道炎症的发生。但迄今为止,相关的研究鲜见报道,并且在Th17细胞与哮喘的研究中,多采用传统的嗜酸细胞性哮喘动物模型。因此本研究通过建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型,并以嗜酸细胞性哮喘小鼠模型作为对照,探讨Th17细胞在中性粒细胞性哮喘发病中的作用及作用机制,并且应用地塞米松干预探讨糖皮质激素对中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用及作用机制。研究的完成将初步阐明Th17细胞在中性粒细胞性哮喘发病中的作用及可能的分子机制,为中性粒细胞性哮喘的早期干预寻找新的作用靶点。研究分四部分进行。目的制作中性粒细胞性哮喘小鼠模型,为后续研究建立基础。方法BALB/c小鼠36只,随机分为3组:正常对照组（NC组）、嗜酸细胞性哮喘模型对照组（EA组）和中性粒细胞性哮喘模型组（NA组）,每组12只。常规方法建立嗜酸细胞性哮喘模型。中性粒细胞性哮喘模型制作:实验第0天、7天和14天在小鼠麻醉后用10μg脂多糖（LPS）鼻内滴入及腹腔内注入50μg卵白蛋白（OVA）联合致敏,从实验第21天起,用5%OVA溶液雾化吸入2周进行激发。正常对照组:用PBS致敏,生理盐水激发。观察小鼠哮喘发作症状,检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数及分类计数,肺组织HE染色观察气道病理学变化。结果两组哮喘模型小鼠在激发过程中均出现烦躁不安、呼吸急促、弓背直立、前肢缩抬、大小便失禁等表现。NC组则无此表现。EA组及NA组小鼠BALF中细胞总数、EOS比例、NEU比例均明显高于NC组（均P<0.01）;与EA组相比,NA组小鼠NEU比例明显升高,BALF中细胞总数、EOS比例则明显降低（均P<0.01）。肺组织病理学改变:EA组支气管壁增厚,粘膜上皮杯状细胞增生,支气管及肺血管周围见以嗜酸细胞为主的大量炎症细胞浸润。NA组小鼠细支气管周围除嗜酸细胞外,还可见较多中性粒细胞、淋巴细胞在气道粘膜下浸润,支气管壁增厚。结论通过LPS及OVA联合致敏的方法,成功建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型。目的探讨中性粒细胞性哮喘发病可能的免疫学机制。方法相同方法建立嗜酸细胞性哮喘和中性粒细胞性哮喘小鼠模型。ELISA方法检测小鼠BALF中IL-17A、IL-4、IFN-γ水平;制备小鼠脾脏及肺脏单细胞悬液,流式细胞技术检测Th1、Th2、Th17细胞占CD4+CD8-T淋巴细胞比例,并进行相关分析。结果NA组小鼠BALF中IL-17A水平明显高于NC组及EA组（均P<0.01）。EA组及NA组小鼠BALF中IL-4水平均明显高于NC组（分别P<0.01,P<0.05）,但两组间比较无显著性差异（P>0.05）。EA组及NA组小鼠BALF中IFN-γ水平均明显低于NC组（分别P<0.01,P<0.05）,但两组间比较无显著性差异（P>0.05）。与NC组相比,NA组小鼠脾脏及肺脏中Th17细胞比例、Th2细胞比例明显升高,Th1细胞比例明显下降（均P<0.01）;与EA组相比,NA组小鼠脾脏及肺脏中Th17细胞比例、肺脏Th1细胞比例明显升高（均P<0.01）,脾脏Th1细胞比例、肺脏Th2细胞比例明显下降（均P<0.01）,脾脏Th2细胞比例无显著性差异（P>0.05）。与NC组相比,EA组小鼠脾脏及肺脏中Th2细胞、Th17细胞比例明显升高,Th1细胞比例明显降低（分别P<0.01,P<0.05,P<0.01）。小鼠肺脏中Th17细胞比例、BALF IL-17A水平均与BALF中NEU比例呈正相关;Th2细胞比例、IL-4水平均与EOS比例呈正相关;Th1细胞比例、IFN-γ水平均与EOS比例呈负相关;Th2细胞比例还与NEU比例呈正相关。结论Th17细胞可能介导了哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生,并通过IL-17发挥作用。目的探讨Th17细胞参与中性粒细胞性哮喘发病可能的转录调控机制。方法相同方法建立嗜酸细胞性哮喘和中性粒细胞性哮喘小鼠模型。免疫组织化学法及免疫印迹法检测小鼠肺组织转录因子RORγt、GATA-3、T-bet蛋白表达,并进行相关分析。结果与NC组相比,NA组小鼠肺组织中RORγt及GATA-3表达明显升高,T-bet表达明显降低（均P<0.01）,RORγt表达及T-bet表达均明显高于EA组（均P<0.01）,而GATA-3表达与EA相比无统计学意义（P>0.05）。与NC组相比,EA组小鼠肺组织中GATA-3表达明显升高,T-bet表达明显降低（均P<0.01）,RORγt表达无显著性差异（P>0.05）。小鼠肺脏RORγt表达量与BALF中IL-17A水平、NEU百分率呈正相关;GATA-3表达量与BALF中IL-4水平、EOS百分率、NEU百分率呈正相关;T-bet表达量与BALF中INF-γ水平呈正相关;而与IL-4水平、EOS百分率呈负相关。结论转录因子RORγt可能与GATA-3共同参与了Th17细胞介导的中性粒细胞性哮喘气道炎症的调控。目的通过地塞米松干预探讨糖皮质激素对中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用及作用机制。方法BALB/c小鼠90只,随机分为5组:NC组、EA组、NA组、嗜酸细胞性哮喘模型激素干预组（EAD组）和中性粒细胞性哮喘模型激素干预组（NAD组）,每组18只。激素干预组致敏及激发方法同模型组,在每次激发前30min应用地塞米松1mg/kg腹腔内注射进行干预。观察小鼠哮喘发作症状,检测BALF中白细胞总数及分类计数;肺组织HE染色;ELISA方法检测小鼠BALF中IL-17A、IL-4、IFN-γ水平;流式细胞检测技术检测小鼠肺脏Th1、Th2、Th17细胞比例;免疫印迹法测定小鼠肺组织RORγt、GATA-3、T-bet蛋白相对含量。结果与NA组小鼠相比,NAD组小鼠BALF细胞总数、NEU比例、EOS比例均明显下降（均P<0.01）,但仍明显高于NC组（分别P<0.01、P<0.05、P<0.01）。而且NAD组小鼠BALF细胞总数明显高于EAD组（P<0.05）。与EA相比,EAD组小鼠BALF细胞总数、EOS比例、NEU比例均明显下降（均P<0.01）,但仍明显高于NC组（分别P<0.01、P<0.05、P<0.01）。与哮喘组相比,两组激素干预组小鼠结构较完整,支气管管壁稍增厚,支气管周围炎性细胞浸润明显减少。与NA组相比,NAD组小鼠肺组织中RORγt、GATA-3、T-bet表达、Th17细胞比例、BALF中IL-17、IFN-γ水平均明显下降（均P<0.01）,其中RORγt表达、Th17细胞比例、IL-17水平与NC组相比均无显著性差异（均P>0.05）,GATA-3表达仍明显高于NC组（P<0.01）;Th2细胞比例明显升高（P<0.01）;Th1细胞比例、IL-4水平无明显变化（P>0.05）。与EA组相比,EAD组小鼠肺组织中GATA-3表达、Th2细胞比例、BALF中IL-4水平均明显下降（均P<0.01）,但仍高于NC组（均P<0.01）;Th1细胞比例明显提高（P<0.01）,且与NC组一致（P>0.05）;BALF中IFN-γ水平、T-bet蛋白表达没有明显变化（均P>0.05）。结论本研究发现地塞米松可部分缓解哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症,其机制可能通过直接抑制RORγt表达,或者通过抑制GATA-3下调RORγt表达,影响Th17细胞分化及IL-17水平,减轻中性粒细胞性气道炎症。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 论文正文：Th17 细胞参与调控哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的分子机制研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 中性粒细胞性哮喘小鼠模型的建立
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、实验结果
• 4、讨论
• 5、参考文献
• 第二部分 哮喘小鼠模型 Th17、Th2、Th1 细胞及相关细胞因子研究
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 5、参考文献
• 第三部分 转录因子 RORγt、GATA-3、T-bet 在哮喘小鼠肺组织中表达以及与气道炎症相关分析
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、实验结果
• 4、讨论
• 5、参考文献
• 第四部分 地塞米松对哮喘小鼠气道炎症影响
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、实验结果
• 4、讨论
• 5、参考文献
• 全文小结
• 创新点及研究展望
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢