论文摘要
尼古丁不仅自然存在于烟草制品中，而且还是烟草植物合成的主要生物碱。由于其杂环化合物结构，尼古丁有很好的水溶性，能够非常容易的穿过生物膜和血脑屏障。在烟草加工过程中存在大量富含尼古丁等烟碱化合物的固体和液体废弃物，易进入地下水，给人们的生存环境带来了极大威胁。1994年，美国环保总局将尼古丁定义为“有毒的危险废弃物”。因此，从烟草废弃物中去除尼古丁或者将这些废弃物转化成有价值的化合物是十分必要的。烟草科学研究合作中心提出“处理烟草废物”，并总结了很多处理方法，微生物处理方法是其中建议的快速处理烟草废物的方法之一。很多微生物能够生长在烟叶及附近土壤中，并利用尼古丁作为唯一碳氮源和能源。在烟草加工过程中这些微生物对于改善尼古丁含量具有重要的作用。研究微生物降解尼古丁的机理可为揭示尼古丁代谢的化学生物学机制和进一步的应用提供理论依据和参考。Pseudomonas putida S16是课题组分离出来的一株以尼古丁为唯一碳氮源生长并能高效降解尼古丁的菌株。前期研究已通过核磁波谱、红外光谱、紫外吸收光谱、气相质谱、高分辨气相质谱等分析手段确定该菌株通过吡咯途径降解尼古丁，但其分子机制还没有报道过，本文以菌株S16为研究对象，构建基因组文库，筛选具有尼古丁降解功能的转化子，对转化子测序分析，并从nic基因簇中亚克隆到nicA和hsp基因，对基因成功表达，从分子水平研究其降解机理及途径。构建了菌株S16的噬菌体和pUC两种基因组文库，从文库中筛选到三个阳性克隆x-2、10-52、GTPF，这三个转化子都能利用尼古丁作为唯一碳氮源生长。利用三个转化子休止细胞进行了尼古丁降解，通过高效液相色谱和薄层层析发现转化子x-2和10-52降解尼古丁代谢途径是一致的。通过测序发现x-2和10-52的基因序列基本一致，x-2的插入片段大小为1．44 kb，10-52插入的片段大小为1．389 kb，两者具有相同的最大开放阅读框架（large open reading frame，largeORF）。通过NCBI比对，发现与一些未知功能的脱氢酶有100％的相似性（如mannitol dehydrogenase），在其最大ORF的831 bp处，与假设的Fe-S氧化还原酶家族Ⅰ有60％相似性（LTLTELGRNLPTKARTKHNIKRIDRLLGNRHLHKE），也与转座子Tn10中的转座酶一段序列相似性高达100％，其功能还未知。通过高分辨质谱仪确定了三个重要化合物：化合物1(C10H13N2O2)的分子离子峰为m／z 193．09715（（M+H）+），化合物2(C10H15N2O2)的分子离子峰为m／z 195．11280（（M+H）+），化合物3(C10H13N2O)的分子离子峰为m／z 177．10224（（M+H）+），这三种化合物都不是尼古丁降解吡咯途径的中间化合物，它们的结构信息还需要进一步分析。通过高效液相色谱、薄层层析和质谱检测发现转化子GTPF能够通过吡咯途径降解尼古丁生成N-甲基麦喔斯明、假氧化尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羟基-3-琥珀酰吡啶、2,5-二羟基吡啶，与原始菌株S16代谢途径吻合，说明该转化子含有吡咯降解途径关键基因，本文主要针对该转化子开展研究。转化子GTPF含有的尼古丁降解基因簇的长度为4,879 bp，该基因簇中含有三个ORF。所有的ORF都是以缬氨酸或者甲硫氨酸起始的，长度都长于100个氨基酸。在基因簇的两端都含有转录调节子的序列。通过分析，在ORF1的上游有SD序列。NCBIBLAST分析发现，ORF1与细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ和NADH脱氢酶亚基Ⅰ有40％的相似性，ORF2序列与Photobacterium profundum SS9假设蛋白有38％相似性，与其它已知功能的蛋白没有任何相似性。ORF3位于ORF2上游，ORF3序列与P．putida F1菌中超螺旋蛋白有97％的相似性，与P．putida KT2440的转录调节子Asnc家族有97％的相似性。这三个ORF与其它杂环化合物降解基因没有相似性，是全新的降解基因。因此，通过进一步的亚克隆分析单个基因的功能是非常必要的。通过PCR的方法对转化子GTPF的基因簇进行了亚克隆，构建了多个重组子，对它们代谢尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羟基-3-琥珀酰吡啶的活力进行了检测。获得了尼古丁降解关键基因nicA，该基因大小为1,854 bp，能够将尼古丁降解至3-琥珀酰吡啶，该基因与其它杂环化合物降解基因没有相似性，将nicA基因在pET系列载体中表达，纯化重组NicA蛋白，初步研究NicA蛋白的性质。通过转化子的休止细胞降解实验、纯酶转化实验推测出了尼古丁代谢途径，补充了与我们课题组报道的代谢途径，并第一次用同位素标记的实验证明了N-甲基麦喔斯明能够自发水解生成假氧化尼古丁。成功克隆了转化6-羟基-3-琥珀酰吡啶生成2,5-二羟基吡啶的酶的基因hsp，该基因与已报道有功能的蛋白没有相似性，属于新的基因，并对该蛋白的二级结构进行了预测，发现该蛋白存在一些Motif与一些功能蛋白有部分相似性。将hsp基因在pET系列载体中表达，纯化重组蛋白HSP羟化酶。在此基础上，初步研究了该酶能够催化HSP生成DHP和琥珀酸半醛。在成功克隆到nicA和hsp基因以后，我们又进行3-琥珀酰吡啶的基因的克隆，但是目前该基因还没有寻找到。根据文献报道，绝大部分的尼古丁降解菌株的降解基因都位于质粒上，可移动遗传物质包括质粒和转座元在新的代谢途径中起到十分重要的作用。本文也采用多种方法对菌株S16的质粒进行分离检测。菌株S16质粒的拷贝数比较低，提取比较困难，通过优化样品制备方法和脉冲场电泳条件，检测到该菌株中可能含有4个质粒，大小分别为60 kb、200 kb、600 kb和1000 kb左右。进一步的分析实验还在进行中。