EDR1,EDR2在植物抗病中的作用研究

论文摘要

摘要稻瘟菌是水稻的主要病害之一,广泛分布于世界各水稻产区。目前,在分子水平上对于稻瘟菌防治的研究,主要集中在克隆水稻抗性基因及稻瘟病病原菌无毒基因。然而,鉴于水稻基因组相对较大,且稻瘟菌生理小种变异严重,导致对于水稻防御稻瘟侵染方面的研究进展缓慢。edrl,edr2为抗白粉突变体,本研究通过将稻瘟菌生理小种Y34分别注射拟南芥生态型Col-0及突变体pen2, edrl, edr2,pad4,sid2, niml,jarl, ein2, edrl/pad4, edrl/sid2, edrl/niml, edrl/jarl, edrl/ein2, edr2/pad4, edr2/sid2, edr2/niml, edr2/jarl, edr2/ein2,观察edrl,edr2及其它株系的抗性及生理反应,为研究水稻防御稻瘟菌的分子机制提供理论依据。取生长4周的拟南芥各株系,注射稻瘟菌生理小种Y34。3天后,取各注射叶片,做苯胺蓝及台盼蓝染色,观察各株系叶片表面化学物质的积累情况。6天后,取各注射叶片,观察叶片病斑大小,以判断各株系对稻瘟菌生理小种Y34的感抗性。7天后,取各注射叶片,台盼蓝染色,观察各株系叶片表面菌丝及孢子生长情况,进一步验证各株系对Y34的感抗情况。结果显示,拟南芥生态型Col-0对Y34敏感,突变体pen2及edrl对Y34的敏感程度比Col-0更严重。edr2及JA/ET途径突变体对Y34的敏感程度与Col-0相当。SA途径相关突变体pad4及edrl/pad4, edr2/pad4的敏感程度低于Col-0,而其他突变体表现为抗Y34。推测EDR1在拟南芥防御稻瘟菌侵染过程中起一定正调控作用,而其作用依赖于SA通路基因SID2, NIM1参与。而EDR2在此过程中的作用不明显或不起作用。研究显示,许多模拟病斑突变体具有对病原菌的抗性。通过EMS诱变拟南芥生态型Col-0种子,经过表型筛选,得到一些模拟病斑突变体,其中一株突变体接种稻瘟菌之后,其病斑面积明显变大,推测该基因可能接到拟南芥防御稻瘟菌的反应。同时,鉴于其感病表型与edrl类似,推测edrl在调控拟南芥防御稻瘟菌的过程中,可能与该基因在有一定联系。为进一步研究EDR1在拟南芥防御稻瘟菌侵染过程中的调控机制,通过图位克隆技术,发现该突变体是由于基因LIN2突变引起。LLN2编码类卟啉原Ⅲ加氧酶（CPO）,是叶绿体和亚铁血红素生物合成途径中的关键酶。其调控拟南芥防御稻瘟菌侵染的机制尚无相关报道。至于EDR1与该基因如何调控植物防御稻瘟菌侵染过程有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词及英汉对照
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 稻瘟菌抗性及EDR1,EDR2作用研究进展
• 1.1.1 稻瘟菌侵染过程
• 1.1.2 稻瘟菌的主要防治方法
• 1.1.3 植物对病害的防御系统
• 1.1.4 参与植物防御的信号分子
• 1.1.5 水稻对稻瘟菌抗性分子机制研究进展
• 1.1.6 稻瘟菌与拟南芥互作
• 1.1.7 EDR1作用机理
• 1.1.8 EDR2作用机理
• 1.2 模拟病斑突变体研究进展
• 1.2.1 细胞程序性死亡
• 1.2.2 模拟病斑突变体
• 1.2.3 模拟病斑突变体研究进展
• 1.3 拟南芥基因的图位克隆（map-based cloning）技术
• 1.3.1 图位克隆原理
• 1.3.2 图位克隆技术
• 1.4 本课题意义
• 2 实验材料
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株及质粒
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 质粒
• 2.3 实验仪器
• 2.4 主要试剂
• 2.5 培养基、试剂配制
• 2.5.1 MS培养基母液配制方法
• 2.5.2 液体LB培养基
• 2.5.3 固体LB培养基
• 2.5.4 质粒提取溶液
• 2.5.5 TE溶液
• 2.5.6 X-gal（20mg/ml）
• 2.5.7 50×TAE
• 2.5.8 拟南芥总DNA提取缓冲液
• 2.5.9 GUS染液
• 2.6 所用网站及软件
• 2.6.1 所用的软件
• 2.6.2 所用的网站
• 2.7 实验引物
• 2.7.1 半定量PCR引物
• 2.7.2 构建载体引物
• 3 实验方法
• 3.1 拟南芥播种
• 3.2 拟南芥生长条件
• 3.3 拟南芥突变体的形态学观察
• 3.4 转基因植株形态与生长观察
• 3.5 稻瘟菌生长条件
• 3.6 接种稻瘟
• 3.7 观察表型
• 3.8 DAB（二氨基联苯胺,Diaminobenzidine）染色,观察过氧化物积累
• 3.9 苯胺蓝（aniline blue）染色,观察胼胝质积累
• 3.10 台盼蓝染色
• 3.11 水煮法提取拟南芥DNA
• 3.12 CTAB法提取拟南芥DNA
• 3.13 提取拟南芥RNA
• 3.14 反转录
• 3.15 半定量PCR
• 3.16 白粉菌培养条件
• 3.17 拟南芥抗白粉菌实验
• 3.18 抗盐分析
• 3.19 突变性状的遗传分析
• 3.20 图位克隆群体的构建
• 3.21 突变基因的初定位
• 3.21.1 拟南芥共有5条染色体
• 3.21.2 PCR扩增
• 3.21.3 突变基因与已知分子标记连锁关系的确定
• 3.22 突变基因的精细定位
• 2遗传群体'>3.22.1 扩大F₂遗传群体
• 3.22.2 精细定位分子标记
• 3.22.3 dCAPs标记的引物的设计
• 3.22.4 重组子的PCR及酶切结果检测
• 3.22.5 突变体后代表型的验证
• 3.23 测序,检测突变基因
• 3.23.1 设计引物
• 3.23.2 PCR扩增
• 3.23.3 PCR产物纯化
• 3.23.4 序列测定
• 3.24 植物互补载体pKAMBIA2300的构建
• 3.24.1 载体构建策略
• 3.24.2 表达载体的PCR鉴定
• 3.24.3 表达载体的酶切鉴定
• 3.25 植物表达载体pMDC83-GFP的构建
• 3.25.1 载体构建策略
• 3.25.2 表达载体的PCR鉴定
• 3.25.3 表达载体的酶切鉴定
• 3.26 植物表达载体pMDC163-GUS的构建
• 3.26.1 载体构建策略
• 3.26.2 表达载体的PCR鉴定
• 3.26.3 表达载体的酶切鉴定
• 3.27 农杆菌侵染液的制备
• 3.28 Dipping法转化
• 3.29 转基因拟南芥植株筛选
• 3.30 转基因植株形态与生长观察
• 3.31 LIN2蛋白的亚细胞定位
• 3.32 LIN2蛋白的组织定位
• 4 实验结果与分析
• 4.1 EDR1,EDR2抗病分析
• 4.1.1 拟南芥不同的生态型及突变体对于Y34的感病程度有差异
• 4.1.2 鉴定SA途径单突在非宿主抗性中的作用
• 4.1.3 双突接菌鉴定SA途径基因对于EDR1作用的影响
• 4.1.4 双突接菌鉴定SA途径基因对于EDR2作用的影响
• 4.1.5 DAB（diaminoben-zidine）染色,观察活性氧积累
• 4.1.6 荧光染料苯胺蓝染色,观察胼胝质积累情况
• 4.1.7 接菌后抗病基因的诱导表达情况
• 4.1.8 台盼蓝染色,观察菌丝生长情况
• 4.2 模拟病斑突变体表型观察
• 4.2.1 突变体的形态学观察
• 4.2.2 组织化学染色
• 4.3 模拟病斑突变体的抗病、抗逆分析
• 4.3.1 抗稻瘟菌实验
• 4.3.2 抗白粉菌实验
• 4.3.3 盐胁迫实验
• 4.4 模拟病斑突变体基因定位
• 4.4.1 突变性状的遗传分析
• 4.4.2 克隆群体的构建
• 4.4.3 突变基因初定位
• 4.4.4 突变基因的精细定位
• 4.4.5 设计引物,测序
• 4.4.6 序列保守性分析
• 4.5 植物表达载体的构建
• 4.5.1 互补表达载体pKAMBIA1300-HB的获得
• 4.5.2 植物表达载体pKAMBIA1300-HB转化农杆菌GV3101
• 4.5.3 表达载体pMDC83-GFP的获得
• 4.5.4 植物表达载体pMDC83-GFP转化农杆菌GV3101
• 4.5.5 表达载体pMDC163-GUS的获得
• 4.5.6 植物表达载体pMDC163-GUS转化农杆菌GV3101
• 4.6 遗传转化研究
• 4.6.1 不同载体对拟南芥的转化及转基因植株的筛选
• 4.6.2 F1代表型观察
• 4.6.3 LIN2蛋白的亚细胞定位
• 4.6.4 LIN2蛋白的组织定位
• 4.7 结果分析
• 4.7.1 EDR1、EDR2在拟南芥防御稻瘟菌过程中的作用分析
• 4.7.2 模拟病斑突变体抗胁迫分析
• 4.7.3 模拟病斑突变体基因定位分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 简历
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表