论文摘要
目的和意义随着现代化和工业化进程的加快,特应性皮炎（AD）患病率增高,是皮肤病和公共卫生领域的研究热点。AD是一种慢性炎症性皮肤病,易反复发作,以湿疹性皮损分布为特征。主要病理生理表现为苔藓样硬化、瘙痒性脱皮和皮肤干燥。AD是一种系统性功能失调性疾病,可同时触发哮喘、过敏性鼻炎和食物过敏,伴有血浆IgE和嗜酸性粒细胞升高。已报道多种细胞参与了AD的发病,如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、朗格汉斯细胞和角质形成细胞,这些细胞都与细胞因子、化学增活素和IgE等血液因子以及与微生物感染有关。虽然大多数AD患者血浆IgE升高,但AD疾病中存在一个亚组对空气、食物过敏原无致敏性。AD疾病可分为两个类型:内源性和外源性。外源性AD（ADe）占AD疾病的70-80%,具有Th2细胞调节的血浆IgE增高,引起IgE介导的致敏作用的特征。与ADe不同,内源性AD（ADi）占AD疾病的20-30%,没有IgE介导的致敏作用和过敏反应。高通量筛选（HTS）方法如DNA芯片和2D-PAGE/MALDI-TOF分析已开始用于AD相关候选基因的筛选。通过HTS,可以找出大量在AD中上调或下调的蛋白质或基因,同时,相互作用组工具如PPI图能有助于核心蛋白的挑选。因为接下来的功能研究是一个耗时、花费较大的过程,所以对目标基因的筛选显得非常重要,因此,通过对HTS结果的计算机预测分析是作出正确选择的关键。PPI图中列出的候选基因为理解复杂的AD疾病提供了重要信息。一旦PPI预测的相互反应配偶体得到证实,将为疾病相关的基因调节途径提供新的见解。已知与AD疾病相关的重要因素有IgE/FcεRI、抗微生物肽、细胞因子/化学增活素、蛋白酶及其受体、脂质基因、自身抗原、细胞外基质基因、表皮分化复合物等。在这个基础上,研发出新的治疗方法,并且已经用于AD的临床治疗。尽管目前对AD的治疗有多种途径,但是AD患者在增加,能否提供有效治疗方法如快速缓解严重症状的方案仍是个严峻的挑战。因此,需要更深入的研究AD的发病机理,进一步阐明其免疫机制。另外本研究还进行了分子水平的环境毒理学研究。环境小分子化学物进入体内,可以与体内最主要的生物大分子一蛋白质发生相互作用,除了通过共价作用形成蛋白加合物外,环境化学物可能会影响蛋白质的构象,导致蛋白质发生错误折叠,从而产生环境健康风险。这种途径是否与折叠病的环境因素有关,迄今为止,这方面的报道较少,有必要开展深入研究。本研究以脑型肌酸激酶（CK-BB）为模型,试图探讨小分子化合物对酶的结构与功能影响。在了解CK-BB去折叠与再折叠过程基础上,进一步对日常生活中人群接触的频率较高的十二烷基硫酸钠（SDS）作用及与CK-BB结合机制进行了探讨,而且阐述了两种可能与退行性疾病相关的环境化学物,丙烯酰胺与锌离子,对CK-BB的结构与功能影响的作用机制。研究方法1.本研究中对患者活检样本、原代细胞培养（角质形成细胞和成纤维细胞）和血清样本中的基因改变进行研究。所有的AD样本分为外源性（ADe）和内源性（ADi）两型。非特异性正常对照组（n=22）,均无个人或家族史,过敏性疾病症状和体征,其样本选自整形外科手术取下的皮肤。从ADe和ADi患者（n=40）皮损处取直径3-5mm活检样本。20名ADe患者（SCORAD:50.09±15.68）,20名ADi患者（SCORAD:46.38±11.77）。ADe组和ADi组总IgE水平、红细胞计数和年龄的平均值分别为:1739 U/mL,625/μL and 27.4岁和105U/mL,248/μL and 28.2岁。所有样本均取自于男性。血清按照之前报道的方法收集,等分试样后储藏在-80℃。DNA芯片的制备按照RNA制备、标记和杂交步骤进行:分别准备正常对照、ADe、ADi样本,每个样本均进行cDNA模板合成和标记。分别采用两种芯片对不同样本进行检测:GeneChip?人U133 Plus 2.0芯片和GenePlorerTwinchip人-8K芯片。基因表达比值经过图像分析,并用LOWESS回归方程标准化。应用SAM和DEG。选择q值（按照5%）有明显表达差异（＞2倍）的基因。GeneChip?人U133 P1us 2.0芯片用来进行ADe和ADi皮肤组织的分析,而GenePlorer Twinchip人-8K芯片用于分析特应性角质形成细胞。自流电泳（FFE）和2-DE分别用于特应性成纤维细胞和血清处理分析。患者源性血清经多重亲和移除柱（MARC）处理后进行2-DE分析。接下来,用苯基琼脂糖树脂分段式方法进行AD血清蛋白质的分析。血清经柱子分离后TCA沉淀。根据以上结果,可采组学工具来进行核心基因和蛋白质的预测。PPI预测使用了PPI的主要算法,包括:1)蛋白结构相互作用使用PSIMAP（蛋白质组图谱）,一种使用SCOP（蛋白结构分类）数据库结构域的方法;2)蛋白质实验性相互作用PEIMAP（蛋白质组图谱）,是一种普遍的使用实验性蛋白相互反应信息资源的方法,如HPRD、BIND、DIP、MINT、IntAct和BioGid。2.重组人CK-BB按照之前报道的方法进行表达和纯化。CK-BB活性测定采用ATP和肌酸反应释放质子,在百里酚蓝指示剂存在下,其597nm光吸收变化速率对应于酶活性。内源荧光和ANS结合光谱方法检测CK-BB三级结构的影响。采用圆二色谱分光光度计,在190-250nm范围内记录远紫外圆二色谱（CD）光谱检测CK-BB二级结构的影响。等温滴定微量量热法采用3101TAMⅢ恒温箱按照之前报道的方法进行测量。从蛋白质数据库（PDB）中获得已知的CK-BB同源性结构。发现同系物牛的视黄醛肌酸激酶A链（PDB编码:1g0w）是一个良好的CK-BB结构模板（含97%相同序列）。结合模拟操作分为:1)计算相应的受体和3D配体,2)对接大小特征,3)计算网格评分,4)决定补充受体和配体对接。结果1.Affymetrix芯片检测出406种差异表达基因（DEG）,在正常人和AD患者（ADe和ADi）之间,鉴别出130个DEG;在正常人和ADe患者之间,鉴别出327个DEG;在正常人和ADi患者之间,鉴别出146个DEG。8K cDNA芯片结果显示在原代培养的角质形成细胞AD疾病中有157个基因失调。接下来,通过FFE在AD成纤维细胞中获得93个候选基因。MARC处理后的AD血清样本检测到30个上调蛋白质和19个下调蛋白质。改进分段方法,检测到9个失调基因。Affymetrix芯片分析利用PSIMAP和PEIMAP两种不同的生物信息学计算方法得到5个和8个核心基因,分别是:PIK3R1、IGF1R、MAPK13、SFN、YWHAE和CORIN、COL14A1、CLCA4、PTPRC、IL10RA、C1S、PHLPP、SLITRK6。应用8K cDNA芯片在角质形成细胞中找出25个基因。通过FFE在AD成纤维细胞中4个核心蛋白在PSIMAP和PEIMAP算法中均检测到,即:I55423、ARR3、YWHAE和EEF1A1。AD血清样本的2-DE结果中发现26种蛋白质。AD组织中SFN和PTPRC经实时PCR进一步验证。结果发现转录水平的SFN在ADi中上调4.5倍,PTPRC在ADe和ADi中分别下调60%和46%。ELISA结果显示,MMP1和MMP10在ADi患者中均上调。ADi患者血清的ELISA研究结果表明,与正常人和ADe患者相比较,MMP1和MMP10显著上调（几乎两倍）,均存在统计学差异,采用随机配对和Wilcoxon检测。2.对SDS使CK-BB的折叠后的失活进行了研究。SDS能非竞争性抑制CK-BB的活性（Ki=1.22mM）。SDS与CK-BB暴露的疏水表面结合诱导其三级结构的改变。SDS配体结合热力学参数的改变如焓、吉布斯自由能和熵分别为-13±7.0MJ/mol,8.39 kJ/mol and-42.754 kJ/（K·mol）。研究明确了重要的CK-BB结构以及和SDS相互反应的折叠和抑制动力学信息。预测的结构具有0.51（?）的均方根偏差。CK-BB与SDS之间对接成功,具有显著性评分（-4.67 kcal/mol,自动对接4和-48.32 kcal/mol,DOCK6）。丙烯酰胺对脑型肌酸激酶（CK-BB）的抑制效应研究发现,CK-BB能被动态的失活并伴随疏水表面的暴露。丙烯酰胺主要与CK-BB的硫氢基（-SH）残基相互作用导致烷化。计算机模拟对接支持丙烯酰胺直接结合到CK-BB的活性位点上,主要与CYS74和GLY73残基相互作用。Zn2+通过剂量依赖效应失活CK-BB（IC50=0.06 mM）。Zn2+显著诱导CK-BB疏水基表面破裂导致三维结构改变。还发现Zn2+能使CK-BB发生聚沉。聚沉依赖于温度以及酶和Zn2+的浓度。结论1.为了更深入了解AD发病机制,明确在AD病情发展中有多少基因起作用,进行了大规模的微阵列研究,得到许多新的相关信息。结果主要集中在AD相关基因大规模DNA芯片研究的描述上,这将为全面了解AD疾病提供新的见解,但是结果中尚不包括详细的功能研究。在后续的实验中进行了AD皮肤组织的研究并检测到了核心基因。然后进行角质形成细胞和成纤维细胞的研究。同时还对AD患者血清中蛋白质差异表达进行了研究。已知多种因子参与了AD的发病,不同的患者中存在多种触发因素,本研究数据提示人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞活化在AD疾病中起作用。然而,在原代培养的角质形成细胞和成纤维细胞中检测到的蛋白质或基因可能提示着体内也存在相应的蛋白质变化,但是mRNA水平和表达的蛋白质水平之间的差异干扰了对AD中准确作用的理解。大规模的芯片研究结果能有助于深入了解AD发病机制的复杂的相关因素。结合表达数据分析和蛋白质相互作用组预测能找到更可靠的与AD疾病相关的基因。预测的蛋白质相互作用配体和核心蛋白能为下一步AD治疗的功能研究提供有效、可靠的靶点。AD患者数量迅速增多,急需找到特异性诊断和敏感性治疗方法。因此,OMICS手段的应用改善了对AD皮肤组织的表达形式以及组分如角质形成细胞和成纤维细胞的研究。根据本研究,得出以下结论:1)生物信息学工具结合HTS数据筛选新的核心基因或蛋白,在今后的功能学研究和临床药物开发中将发挥重要作用;2)本研究中发现多个在AD源性样本中表达显著改变的重要基因,如SFN、PTPRC、MMP1和MMP10,可能是AD疾病的生物学标记;3)本研究中预测出的大部分核心蛋白、以及实时PCR检测出的候选基因/蛋白在之前关于AD发病机制的研究中未见报道;4)结合基因组学、蛋白质组学和相互作用组分析方法等研究手段将有助于AD复杂病理机制的研究,以及准确的生物标记物或临床治疗靶点的探测。2.本部分研究我们以脑型肌酸激酶（CK-BB）为模型,探讨了小分子工业化学物通过影响酶的结构和功能,引发蛋白质错去折叠,导致酶的失活以及聚沉的毒理途径。不管是SDS（两亲变性剂）,丙烯酰胺（巯基加合物）,还是Zn2+（金属离子）,都可以诱导蛋白质疏水表面的暴露。尤其是Zn2+促发CK-BB发生聚沉。这种由小分子化学物诱发的聚沉现象在许多退行性病变中可能具有重要的意义,其确切的病理价值有待进一步深入研究。环境中存在大量的具有慢性神经毒作用的工业化学品。这些小分子化学物是含具有协同作用,诱导蛋白质构象与功能的变化将是一个重要的研究课题。
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相关论文文献
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- [2].“Omics” in pharmaceutical research: overview, applications, challenges, and future perspectives[J]. Chinese Journal of Natural Medicines 2015(01)
- [3].整合多个组学(omics)分析植物代谢产物及其功能[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版) 2013(03)