表皮生长因子受体反式调节G蛋白偶联受体功能的研究

论文摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）是一类重要的细胞表面受体超家族。GPCR的细胞内信号主要由G蛋白介导。激动剂反复刺激能启动受体负反馈调控机制,使受体对激动剂的反应性下降,即发生受体的脱敏。激动剂诱导的GPCR的磷酸化和内吞是GPCR介导信号的负调控的主要机制。G蛋白偶联受体激酶（GRK）是催化激动剂诱导的GPCR磷酸化以及启动受体脱敏的关键激酶,GRK的亚细胞分布和功能的改变显著影响了GPCR的功能。受体酪氨酸激酶（RTK）是另一类跨膜受体家族,参与了很多细胞功能的调节。最近的研究发现GRK2也参与了受体酪氨酸激酶信号的调节。我们以前的研究发现激活受体酪氨酸激酶（RTK）家族的一员,表皮生长因子受体（EGFR）,可以诱导GRK2和EGFR形成复合物。本研究在以前的工作基础上,以EGFR和阿片受体为模型探索了受体酪氨酸激酶对G蛋白偶联受体功能的调控作用及其机制。本研究结果表明:1)EGF（100ng/ml）预处理20分钟促进了6阿片受体（DOR）的特异性激动剂DPDPE诱导的DOR的内吞,DOR羧基末端三个主要的GRK2磷酸化位点突变为丙氨酸的突变体（M4/5/6）也可以进行DPDPE依赖的内吞,但是EGF预处理不能促进DPDPE诱导的M4/5/6的内吞。这一结果提示GRK2催化的DOR的磷酸化在EGF预处理导致的DPDPE依赖的DOR的内吞增加中是必需的。2)EGF刺激诱导了GRK2的膜转位并且和EGFR形成复合物。我们构建了GRK2的缺失突变体,发现GRK2主要通过它的催化域和EGFR结合。3)进一步的实验发现EGF刺激诱导了GRK2的酪氨酸磷酸化,我们通过点突变GRK2上的酪氨酸位点发现EGF诱导的GRK2的酪氨酸磷酸化主要发生在GRK2氨基端的13,86,92酪氨酸上。并且这一过程不需要EGFR下游的非受体型酪氨酸激酶Src的参与,提示GRK2的磷酸化是EGFR直接催化的结果。4)体外结合实验和体外激酶实验证明GRK2可以和EGFR直接相互作用,在体外EGFR可以催化磷酸化GRK2。同时在细胞内过表达GRK2的催化域肽段（GRK2-CD）竞争GRK2和EGFR的结合,显著抑制了EGF诱导的GRK2的酪氨酸磷酸化。这一结果提示在体内激活的EGFR催化磷酸化GRK2氨基端的酪氨酸残基发生磷酸化,EGFR和GRK2催化域的结合对于EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化是必需的。5)EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化增强了GRK2的激酶活性:在过表达EGFR、DOR和GRK2的HEK293细胞内,EGF刺激增强了DOR的基础磷酸化水平;而在过表达酪氨酸位点突变的GRK2的细胞内,EGF诱导的DOR的磷酸化则被明显削弱了。6)我们进一步研究了EGF刺激对其它G蛋白偶联受体的影响,我们检测了μ阿片受体（MOR）在EGF刺激后的内吞情况,我们发现EGF刺激诱导了野生型MOR的内吞,而MOR磷酸化位点缺失的突变体MOR363/370/375A不能被EGF诱导发生内吞,干扰GRK2的蛋白水平明显抑制了EGF诱导的MOR的内吞。这一结果提示GRK2也介导了EGF诱导的MOR的内吞。我们首次发现受体酪氨酸激酶信号通路的激活可以调节G蛋白偶联受体的内吞。EGF预处理增加了DPDPE诱导的6阿片受体的内吞,我们通过体外和体内的实验证明这一过程是通过EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化和激活而实现的,并且首次发现并证明GRK2是EGFR的底物。我们进一步证明EGFR对G蛋白偶联受体的调节作用不仅仅局限于6阿片受体,EGFR也可以调节μ阿片受体的内吞,并且这一过程是GRK2介导的。提示EGFR对G蛋白偶联受体的调节作用可能是一个普遍的现象,同时GRK2可能是受体酪氨酸激酶调节GPCR信号通路的关键中介分子。阿片受体是一类G蛋白偶联受体,阿片类药物与神经系统的阿片受体结合产生镇痛作用,最近的研究发现阿片受体在很多肿瘤细胞内都有表达,并且肿瘤细胞膜表面阿片受体的表达量和肿瘤的生长速率呈负相关。很多肿瘤细胞都伴有EGFR的过表达或持续激活。EGFR对阿片受体的反式调节可能在肿瘤发生中发挥了重要的作用。

论文目录

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