水稻、玉米叶绿体蛋白组学的研究和玉米叶绿体转化体系的建立

论文摘要

叶绿体是细胞核外存在遗传物质的细胞器之一,但是叶绿体基因组仅编码80-100种蛋白质,叶绿体代谢所需的其它蛋白质都是有核基因组编码。由于叶绿体的膜结构比较复杂,叶绿体蛋白质的提取、分析比较困难,对完整的叶绿体蛋白组学研究是一种挑战,仅限于拟南芥等植物,在水稻、玉米中还未进行深入研究。当前随着分子生物学技术的发展,特别是质谱技术的发展,蛋白组学向着高通量、高灵敏度方向发展,使叶绿体完整蛋白组学的研究成为可能,利用最新发展的技术,并与传统技术相结合,我们对重要的粮食作物玉米、水稻的叶绿体蛋白组学进行了研究。首先通过超速离心纯化出完整的玉米、水稻的叶绿体,优化传统叶绿体蛋白的提取方法,获得较高水平的叶绿体可溶性总蛋白,进行蛋白电泳,通过Orbitrap质谱技术进行分析,结果获得玉米叶绿体总蛋白620种,在PPDB中进行比对分析,明确定位在叶绿体的有368种,定位在胞质中的有160种,线粒体的56种;并鉴定17种新定位在叶绿体的蛋白质;获得水稻叶绿体总蛋白质231种,与PPDB进行比对分析,明确定位在叶绿体的有112种,细胞质的有93种,线粒体的有26种。以上经与PPDB比对分析结果表明定位在细胞质、线粒体的蛋白质,可能在叶绿体中也存在,它们在PPDB中大部分是预测的蛋白质,但是本研究的质谱分析首次初步认定这些蛋白质为表达的蛋白。本研究通过对玉米、水稻的叶绿体蛋白组学研究,为叶绿体蛋白组学提供更多的信息,对叶绿体中光合系统、各类酶类、代谢途径等方面的研究提供依据。叶绿体转化是利用同源重组的原理将目的基因定点重组到叶绿体基因组中,从而使目的基因在叶绿体中进行表达。叶绿体转化体系具有表达效率高,环境安全性好等优势。叶绿体转化已经在衣藻、烟草、拟南芥、水稻等植物中取得成功。本研究以重要粮食作物玉米为研究对象,构建玉米叶绿体表达载体,通过基因枪的方法转化玉米愈伤组织,以期建立玉米叶绿体转化体系。首先克隆了玉米叶绿体的16SrRNA的启动子prrn和终止子rbcL3’,并对启动子进行了优化,引入rbcL基因的SD序列及与翻译有关的核苷酸序列,以增强该启动子的翻译能力。设计引物克隆三对约1.5kb的基因片段:trnC、ropB,atpB、rbcL和trnL、ndhD,作为目的基因与叶绿体基因组进行同源重组的同源片段,选择优化后的除草剂抗性基因EPSPSA15N作为目的基因,以潮霉素抗性作为筛选标记,构建获得玉米叶绿体转化载体pCB-PTN、pBR-PTN。通过基因枪的方法转化玉米愈伤组织,目前正在分化筛选,以期获得玉米叶绿体再生植株,建立玉米叶绿体转化体系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 叶绿体蛋白质组学研究进展
• 1.1.1 蛋白组学研究的相关技术
• 1.1.2 叶绿体蛋白组学的最新进展
• 1.1.3 展望
• 1.2 叶绿体转化的进展
• 1.2.1 叶绿体转化的优点
• 1.2.2 叶绿体转化的方法
• 1.2.3 叶绿体转化的筛选标记
• 1.2.4 叶绿体转化待解决的问题
• 1.3 抗草甘膦植物的研究进展
• 1.3.1 草甘膦的作用机制
• 1.3.2 抗草甘膦作物遗传改良的策略
• 1.3.3 EPSPS 基因的克隆
• 1.3.4 抗草甘膦作物的研究现状
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.4.1 研究的目的和意义
• 第二章 水稻玉米叶绿体蛋白组学
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 叶绿体的提取
• 2.2.2 叶绿体的纯化
• 2.2.3 叶绿体纯度的检测
• 2.2.4 叶绿体蛋白的提取
• 2.2.5 蛋白质浓度的测定（Bradford 法测蛋白浓度）
• 2.2.6 SDS-PAGE
• 2.2.7 单向电泳的胶内酶解（In-gel Digest of a gel band from SDS-PAGE）
• 2.2.8 二级质谱（LC-ESI-MS/MS）
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 水稻叶绿体超速离心
• 2.3.2 水稻叶绿体纯度检测
• 2.3.3 Bradford 法测蛋白浓度标准曲线
• 2.3.4 水稻叶绿体蛋白质电泳图
• 2.3.5 水稻叶绿体蛋白质的二级质谱结果
• 2.3.6 玉米叶绿体超速离心
• 2.3.7 玉米叶绿体纯度检测
• 2.3.8 玉米叶绿体蛋白质的电泳图
• 2.3.9 玉米叶绿体蛋白质的二级质谱结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 水稻、玉米叶绿体蛋白质
• 第三章 玉米叶绿体转化体系的建立
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 常用的试剂和工具酶
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 玉米叶绿体分离和叶绿体基因组的提取纯化
• 3.2.2 同源载体构建
• 3.2.3 玻璃奶法纯化回收DNA 片段
• 3.2.4 大肠杆菌热激感受态细胞的制备
• 3.2.5 连接反应
• 3.2.6 质粒DNA 或连接产物的转化热激感受态细胞
• 3.2.7 一步法鉴定
• 3.2.8 碱法少量快速抽提质粒DNA
• 3.2.9 酶切反应
• 3.2.10 玉米幼胚的分离及愈伤组织的诱导
• 3.2.11 转化受体材料的准备
• 3.2.12 微粒子弹（DNA coated microprojectiles）的制备
• 3.2.13 装备基因枪
• 3.2.14 转化玉米愈伤的过渡培养及抗性筛选培养
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 玉米 16SrRNA 启动子和 rbcL 终止子的克隆
• 3.3.2 玉米叶绿体同源片段的构建
• 3.3.3 玉米叶绿体转化载体的构建
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 攻读硕士期间发表论文