大麦Isa-H1基因在玉米中遗传转化的研究

论文摘要

玉米是重要的粮食作物之一。玉米成熟期存在一种灾害,即遇到阴雨天气,穗上发芽,称之为穗发芽（PHS）。穗发芽能够导致玉米品质下降。大麦α-淀粉酶抑蛋白（BASI）,可有效抑制α-淀粉酶活性,在小麦遗传背景中表达可改善淀粉品质和增加穗发芽抗性。所以本研究克隆了α-淀粉酶抑制蛋白基因Isa-H1和大麦胚乳特异启动子Horp,构建了植物高效表达载体pHorp-Isa-H1。建立了稳定的遗传转化体系,并通过农杆菌介导和花粉管转化的方法将其转入骨干玉米自交系。取得进展如下:用PCR方法扩增Horp和Isa-H1全长,测序后将Horp、Isa-H1连接到切除35S和GUS基因的pCAMBIA3301载体上,最后获得植物表达载体pHorp-Isa-H1。在玉米遗传转化中,由于基因型限制,作为转化受体的自交系较少。本实验从40个玉米自交系中筛选出优良玉米自交系Y412、Y423作为受体材料。发现这两个材料的幼胚均可大量高效的诱导出玉米体细胞胚胎,而且诱导出的体胚能够长时间继代无限繁殖,无外源激素调控就可两极同时分化以及分化率和成苗率极高等特点。将构建好的植物表达载体pHorp-Isa-H1转化到农杆菌EHA105中,对玉米愈伤进行转化,PPT筛选抗性愈伤并分化成苗。对抗性植株进行了PCR分子检测,获得了13株转基因植株。在转化受体系统选择时,发现玉米的茎节,离体培养具有双极性,能够快速成长为完整植株。随机选取了5个优良玉米自交系,对其进行了重复试验,结果证明此方法不存在基因型限制,转化周期也大大缩短,为玉米的遗传转化提供了一个新的受体系统。实验还直接对玉米的幼胚进行了转化试验。选取2个玉米自交系的幼胚,进行农杆菌侵染,结果发现这种方法简便易行,抗性苗成苗率高,克服了玉米遗传转化过程中基因型障碍问题,加快了玉米转基因研究进程。利用花粉管通道法介导的遗传转化体系,将构建好的植物表达载体pHorp- Isa-H1转入玉米自交系,并成功获得了12株T0代转基因植株。将T0代种子以穗为单位收获后,提取了T1代胚乳DNA进行了PCR检测,结果显示,55%的T1种子都含有外源的目的基因,目前已获得T2代种子。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 玉米穗发芽现象、HORP 和ISA-H1 的研究进展
• 1.1 穗发芽的机理研究和影响因素
• 1.1.1 遗传因素
• 1.1.2 环境因素
• 1.2 大麦Isa-H1 基因和胚乳特异启动子Horp 的研究进展
• 1.2.1 麦类ASI 家族
• 1.2.2 大麦α-淀粉酶抑制蛋白的研究概况
• 1.2.3 Isa-H1 基因导入其他作物的研究
• 1.2.4 大麦胚乳特异启动子Horp 的研究概况
• 第二章 玉米遗传转化的研究进展
• 2.1 转化受体体系的建立
• 2.1.1 玉米组织培养技术的研究概况
• 2.1.2 体细胞胚胎的研究概况
• 2.2 转化方法的研究
• 2.2.1 农杆菌侵染法
• 2.2.2 花粉管通道法
• 2.2.3 基因枪法
• 2.2.4 PEG 法
• 2.2.5 其他方法
• 第三章 研究目的和意义
• 第二部分 遗传转化体系的建立
• 第一章 植物表达载体的构建
• 1.1 实验材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 试验所需试剂及培养基的配制
• 1.5 试验仪器
• 1.6 序列分析软件
• 1.7 试验方法
• 1.7.1 大麦总DNA 的提取
• 1.7.2 引物设计
• 1.7.3 PCR 反应
• 1.7.4 目的片段的回收
• 1.7.5 目的片段连接克隆载体PGM-T
• 1.7.6 连接目的片段
• 1.7.7 重组质粒的转化
• 1.7.8 重组质粒的提取
• 1.7.9 重组质粒的鉴定
• 1.7.10 测序及序列分析
• 1.7.11 植物表达载体的构建
• 1.8 结果与分析
• 1.8.1 基因的克隆后
• 1.8.2 植物表达载体的构建
• 1.9 讨论
• 1.10 小结
• 第二章 遗传转化体系的建立
• 2.1 以幼胚诱导的体胚为受体材料的遗传转化体系的建立
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 培养及配方
• 2.1.5 方法
• 2.1.6 结果与分析
• 2.1.7 讨论
• 2.1.8 小结
• 2.2 以茎节为受体材料的遗传转化体系的建立
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 菌株菌体
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养及配方
• 2.2.5 方法
• 2.2.6 结果与分析
• 2.2.7 讨论
• 2.2.8 小结
• 2.3 以幼胚为受体材料的遗传转化体系的建立
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 菌株和载体
• 2.3.3 实验仪器
• 2.3.4 培养及配方
• 2.3.5 方法
• 2.3.6 结果与分析
• 2.3.7 讨论
• 2.3.8 小结
• 第三章 花粉管通道法介导的玉米转基因植株的获得
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 质粒DNA 的准备
• 3.3.2 质粒DNA 的注入
• 3.3.3 抗性植株的筛选
• 3.3.4 T0 代转基因植株的分子检测
• 3.3.5 T1 代种子的分子检测
• 3.4 结果与分析
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介及科研成果