山东省四大湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌毒素型调查及致病机理研究

论文摘要

目的:研究产气荚膜梭菌在淡水鱼消化道的分布及毒素型、进一步阐明鱼类产气荚膜梭菌的来源及产气荚膜梭菌的致病机理。方法:通过初步实验,自健康的活淡水鱼肠内容物中成功分离出产气荚膜梭菌,并建立了产气荚膜梭菌毒素型鉴定的三步PCR检测体系,在此基础上展开了对山东省主要湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌分布及毒素型调查,并将产气荚膜梭菌鱼类分离菌株α毒素全长基因进行克隆和核苷酸序列测定,与不同来源分离株进行同源性比较;进一步用Repetitive-Element PCR对同一采样环境的鱼源、泥源、禽源产气荚膜梭菌分离株进行基因相似性分析。本实验还进行了产气荚膜梭菌鱼源分离株对本动物及小白鼠的致病性试验,通过病理切片及免疫组织化学反应进一步阐明产气荚膜梭菌的致病机理。结果:自四大湖（库）淡水鱼及周围环境中共分离到产气荚膜梭菌141株,其中鱼源129株,泥源8株,鸭源4株;分离株主要为C型（102株,72.3%）,其次为A型（35株,24.8%）,B型（4株,2.8%）。C型和A型均携带cpe基因,而且β2毒素基因检出率较高。分离菌株α毒素全基因序列与A型畜禽源分离株及德国空气分离株的同源性为97.84-99.58%。Repetitive-Element PCR分析表明,同一采样湖（库）分离株基因相似性自45-100%,在每个湖区的分离株中,不同个体的鱼源分离株之间、鱼源与鸭源分离株之间、鱼源与泥源分离株之间均发现了相似性为92%甚至100%的产气荚膜梭菌分离株,表明产气荚膜梭菌在水体、在水体和周围环境间的传播。动物实验表明:产气荚膜梭菌鱼源分离株对本动物和小白鼠均有致病性,相同毒素型的鱼源分离株与标准菌株,稀释倍数相同时感染小白鼠,死亡率差异不显著;各型产气荚膜梭菌菌液与外毒素培养液对小白鼠的致死率差异不显著;相同剂量的菌液灌服与腹腔注射,小白鼠死亡率差异不显著,此结果肯定了产气荚膜梭菌经口感染的高效性。创新:本试验建立产气荚膜梭菌毒素基因检测的三步PCR体系,此体系克服了以往六重体系容易漏检β和肠毒素基因的缺点,与毒素的单基因PCR检测结果完全一致。应用该体系首次于淡水鱼产气荚膜梭菌分离株检测到α、β、ε、β2和肠毒素基因,首次在鱼检测到β、ε和肠毒素基因,首次在B型菌检测到β2毒素基因,从而验证了Tammy的推断:β2毒素可由各型菌产生。应用免疫组织化学方法证明产气荚膜梭菌毒素蛋白定位在肝、心、脑、脾、肺、肾等主质细胞的细胞质内,从而可以肯定产气荚膜梭菌感染动物可以形成毒血症,毒素侵害延髓的生命中枢以及心脏的传导系统是导致“猝死症”发生的原因。本研究共分七部分:第一部分:淡水鱼产气荚膜梭菌的分离和初步鉴定鲤鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲶鱼、罗非鱼、黄鳝等肠内容物样品,厌氧环境下经过增菌、分离培养,选取血琼脂平板上典型的带双溶血环的菌落通过镜检、牛乳暴烈发酵试验及API 20A bioMerieux厌氧菌生化鉴定系统等细菌学方法,初步鉴定为产气荚膜梭菌,分离菌株通过α毒素基因（cpa）的PCR检测进一步确认,淡水鱼肠内容物中可以分离出产气荚膜梭菌,而肠壁分离结果为阴性。第二部分:产气荚膜梭菌毒素基因三步PCR检测体系的建立针对以往产气荚膜梭菌Multi-PCR检测体系容易漏检cpb、cpe基因的缺点,以A、B、C、D、E各型标准菌株为待检,建立了产气荚膜梭菌毒素型鉴定的三步PCR检测体系,即六种毒素基因的检测通过三次PCR反应完成, cpa、cpb2、etx、iA的四重PCR检测及cpb和cpe的单基因PCR检测,并通过特异性实验、扩增产物的核苷酸序列测定检验体系的可靠性,通过条件优化实验在各组分用量及反应温度方面进行优化,建立了最佳的反应体系。用此体系对实验一经PCR证实的产气荚膜梭菌分离株进行六种毒素基因（cpa、cpb2、etx、iA、cpb和cpe）检测,结果7株中有5株为C型、2株为A型,扩增产物核苷酸序列与Genebank上发表的同类序列Identity值在96%以上,排除了假阳性,也进一步验证了该方法的实用性。第三部分:山东省四大湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌的分布及毒素型调查对山东境内微山湖、雪野湖、东平湖及胜利水库采集鱼样、水样、泥样,首先测定水样大肠菌群MPN以确定水质受粪便污染情况,从而初步推测水体中产气荚膜梭菌存在的可能性,然后分离鱼肠内容物及泥样中的产气荚膜梭菌、三步PCR方法鉴定毒素型并且对扩增产物进行克隆和核苷酸序列测定,然后Blastn在线分析检出基因与GeneBank发表的相应毒素基因的同源性。本实验共分离到产气荚膜梭菌141株,其中鱼源129株,泥源8株,鸭4株;分离株主要为C型（102株,72.3%）,其次为A型（35株,24.8%）,B型（4株,2.8%）, C型和A型分离株均检出β2和肠毒素基因,检出基因核苷酸序列（见附表）与GeneBank所发表的相应毒素基因同源性在96%以上。第四部分:产气荚膜梭菌淡水鱼分离株与其它来源分离株的α毒素全基因序列分析应用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌淡水鱼分离株中扩增出产气荚膜梭菌α毒素全基因,并将其与pMD18-T载体连接、用DH5α感受态细胞转化,然后进行克隆和核苷酸序列测定。核苷酸序列分析证实,测序得到的α毒素全基因由1254 bp组成,包括1194 bp的转录区,自13位的ATG至2个连续的TAA,编码398个氨基酸,分子量为45KD,与目前已报道的其他α毒素一致,表明已成功克隆了α毒素全基因。C型产气荚膜梭菌淡水鱼分离株α毒素全基因序列与其他来源的A型产气荚膜梭菌α毒素全基因序列同源性为97.84～99.58%。第五部分:Repetitive-Element PCR对产气荚膜梭菌基因相似性检测为了研究同一湖（库）中不同来源及不同湖（库）同一毒素型产气荚膜梭菌的同源性,采用随机引物利用产气荚膜梭菌基因间重复一致序列的聚合酶链式反应（Repetitive-Element PCR）鉴定技术,扩增不同菌株的产气荚膜梭菌的DNA条带,形成聚类图谱,通过不同分离株的遗传相似性分析,确认同源性,基因相似性在90%以上的可视为起源相同的分离株。结果显示:同一采样湖（库）分离株基因相似性自45～100%,在每个湖区的分离株中,不同个体的鱼源分离株之间、鱼源与鸭源分离株之间、鱼源与泥源分离株之间均发现了相似性为92%甚至100%的产气荚膜梭菌分离株,表明产气荚膜梭菌在水体、在水体和周围环境间的传播。第六部分:产气荚膜梭菌淡水鱼分离株对鱼及小白鼠致病性实验针对未见产气荚膜梭菌引起鱼类疾病的报道,为确定产气荚膜梭菌淡水鱼分离株对本动物、哺乳动物的致病性特设计此实验。本实验以产气荚膜梭菌鲫鱼分离株为试验菌株,并以同型标准菌株为对照,用该菌的粗制外毒素对鱼类及小白鼠进行攻毒,Reed-Muench法计算毒素的半数致死量,同型试验菌株与对照菌株,稀释倍数相同时,对小白鼠的死亡率进行差异显著性检验。结果表明:产气荚膜梭菌鱼源分离株对本动物和小白鼠均有致病性,相同毒素型的鱼源分离株与标准菌株,稀释倍数相同时感染小白鼠,死亡率差异不显著。第七部分:产气荚膜梭菌致病机理研究以小白鼠为实验动物,以产气荚膜梭菌标准菌株A （ ATCC528 ）、B（ATCC6121）、C（ATCC4989）、C（ATCC3180）和鲫鱼分离株DPJ12、DPJ4为试验菌株,进行菌液不同感染途径（灌服和腹腔注射）对小白鼠的致病性试验;同时制备的菌液与外毒素培养液灌服对小白鼠的致病性比较。在此基础上以C4989菌液灌服小白鼠,取24h后死亡小鼠的肝、心、脑、脾、肺、肾等器官为待检标本,分离产气荚膜梭菌菌体,然后以各器官组织提取的DNA为模板,用PCR方法检测其中的α毒素基因;肝、心、脑、脾、肺、肾、肌肉等器官制作组织切片,进行HE与免疫组织化学染色,观察病理变化并对器官中的毒素蛋白进行检测并定位。结果,各型产气荚膜梭菌外毒素培养液与菌液对小白鼠死亡率差异不显著,菌液灌服与腹腔注射对小白鼠致死性（死亡率）差异不显著,此结果肯定了产气荚膜梭菌经口感染的高效性。菌液和毒素灌服死亡小鼠呈全身出血性变化,肠粘膜脱落;在肝脏中可分离到产气荚膜梭菌菌体,其它器官未分离到;在肝、心、脑、脾、肺、肾等器官中均可检测到cpa基因与毒素蛋白,且毒素主要定位在主质细胞细胞质内。由此推断产气荚膜梭菌经口感染时能破坏肠粘膜上皮,进入血液循环,形成低菌血症与毒血症,毒素破坏主质细胞的细胞膜进入细胞质内,毒素侵害延髓的生命中枢以及心脏的传导系统是导致“猝死症”发生的原因。

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引言

1 产气荚膜梭菌简介

2 产气荚膜梭菌主要致病毒素的研究进展

2.1 α毒素的结构与功能.

2.2 β毒素的结构与功能

2.3 ε毒素结构与功能

2.4 ι 毒素的结构与功能

2.5 肠毒素的结构与功能

2.6 β2 毒素的结构与功能

3 产气荚膜梭菌主要致病基因的检测

4 研究的目的及意义

4.1 产气荚膜梭菌与食物中毒

4.2 鱼类产气荚膜梭菌的研究现状

4.3 产气荚膜梭菌的致病机理

实验一淡水鱼产气荚膜梭菌的分离和初步鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 淡水鱼肠壁及肠内容物中产气荚膜梭菌的直接检查

1.2.2 肠壁增菌后产气荚膜梭菌的分离培养

1.2.3 肠内容物增菌后产气荚膜梭菌的分离培养

1.2.4 疑似产气荚膜梭菌菌落的生化鉴定

1.2.5 分离株的PCR 鉴定

1.2.6 产气荚膜梭菌分离菌株的保存

2 结果与分析

2.1 鱼肠壁及肠内容物产气荚膜梭菌的直接分离培养结果

2.2 鱼肠壁及肠内容物产气荚膜梭菌的增菌培养结果

2.3 典型菌落菌体形态和运动性观察

2.4 分离菌株生化试验结果

2.5 分离菌株 PCR 鉴定结果

3 讨论

实验二产气荚膜梭菌毒素基因PCR 检测体系的建立

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 产气荚膜梭菌六种毒素基因的三步PCR 检测体系

1.2.2 三步PCR 检测体系对标准菌株的扩增

1.2.3 PCR 特异性实验

1.2.4 三步PCR 检测体系对产气荚膜梭菌淡水鱼分离株毒素基因的检测

2 结果

2.1 三步PCR 对产气荚膜梭菌参考菌株的检测结果

2.2 PCR 特异性实验结果

2.3 PCR 检测体系对产气荚膜梭菌淡水鱼分离株毒素基因的检测结果

3 讨论

3.1 PCR 反应次数的确定

3.2 多基因PCR 检测体系中各引物的浓度

3.3 PCR 反应模板的制备方法

3.4 PCR 反应程序的退火温度

实验三山东省主要湖库淡水鱼产气荚膜梭菌分布及毒素型调查

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 样品采集

1.2.2 水样大肠菌群MPN 的测定

1.2.3 水样、泥样、鱼肠内容物、鸭粪便中产气荚膜梭菌的分离与初步鉴定

1.2.4 分离菌株毒素基因的检测

1.2.5 扩增产物的克隆、核苷酸序列测定及序列分析

1.2.6 鱼肉中产气荚膜梭菌α毒素基因的检测

2 结果

2.1 水样大肠菌群MPN 测定结果

2.2 产气荚膜梭菌分离结果

2.3 产气荚膜梭菌分离株毒素基因检测结果

2.4 扩增片断的克隆及核苷酸序列测定结果

2.5 鱼肉中产气荚膜梭菌α毒素基因的检测

3 讨论

3.1 水样大肠菌群MPN 测定的意义

3.2 鱼肠内容物中产气荚膜梭菌的来源

3.3 产气荚膜梭菌鱼源分离株的毒素型

3.4 与人类食品安全的关系

3.5 产气荚膜梭菌对鱼的致病性

实验四产气荚膜梭菌淡水鱼分离株与其它来源分离株的α毒素全基因序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 α毒素全基因的PCR 扩增

1.2.2 α毒素全基因的克隆及核苷酸序列测定

1.2.3 C 型产气荚膜梭菌淡水鱼分离株与畜禽源A 型分离株α毒素全基因的同源性

2 结果

2.1 α毒素全基因PCR 扩增

2.2 α毒素全基因的克隆

2.2.1 阳性斑的选取及核苷酸序列测定结果

2.2.2 α毒素基因核苷酸序列分析

2.2.3 产气荚膜梭菌淡水鱼分离株α毒素基因核苷酸序列与其他来源产气荚膜梭菌分离株的同源性比较

3 讨论

实验五 Repetitive-Element PCR 对产气荚膜梭菌基因相似性检测

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 Repetitive-Element PCR 扩增

1.2.2 Repetitive-Element PCR 结果分析

2 结果

2.1 微山湖产气荚膜梭菌泥源、鱼源、鸭源分离株的Repetitive-Element PCR 结果

2.2 雪野湖产气荚膜梭菌泥源、鱼源分离株的Repetitive-Element PCR 结果

2.3 东平湖产气荚膜梭菌泥源、鱼源分离株的Repetitive-Element PCR 结果

3 讨论

实验六产气荚膜梭菌淡水鱼分离株对鱼类及小白鼠致病性实验

1 材料

2 方法

2.1 产气荚膜梭菌菌液制备

2.2 外毒素的粗制

2.3 产气荚膜梭菌淡水鱼分离株对淡水鱼及小白鼠的致病性

2.3.1 坏死性试验

2.3.2 致死性试验

2.3.3 参考及分离菌株粗制外毒素对小白鼠的半数致死量（LD50）的测定

2.4 DPJ12、DPJ4 的粗制外毒素对鲫鱼半数致死量（LD50）的测定

2.5 DPJ12、DPJ4 对鲫鱼及小白鼠的致病性比较

3 结果

3.1 产气荚膜梭菌外毒素的浓度

3.2 产气荚膜梭菌淡水鱼分离株毒素对小白鼠的坏死性实验结果

3.3 产气荚膜梭菌淡水鱼分离株毒素致死性试验结果

3.4 毒素半数致死量的测定结果

3.5 DPJ12、DPJ4 的粗制外毒素对鲫鱼半数致死量（LD50）的测定结果

3.6 统计结果

4 讨论

实验七产气荚膜梭菌致病机理研究

1 材料

2 方法

2.1 产气荚膜梭菌菌液及外毒素培养液制备

2.2 产气荚膜梭菌菌液致病性实验

2.3 产气荚膜梭菌毒素培养液与肉汤培养菌液致病性对照实验

2.4 组织器官中产气荚膜梭菌的分离及α毒素基因的检测

2.4.1 病料的制备

2.5 攻毒死亡鼠的病理组织学及毒素蛋白的免疫组织化学检查

2.5.1 病理组织学检查

2.5.2 毒素蛋白的免疫组织化学检测

3 结果

3.1 菌液不同接种途径的致病性试验结果

3.2 产气荚膜梭菌毒素培养液与菌液致病性对照实验结果

3.3 组织器官中产气荚膜梭菌的分离结果

3.4 组织中产气荚膜梭菌α毒素基因检测结果

3.5 产气荚膜梭菌外毒素攻毒小鼠病理组织学变化及毒素蛋白的免疫组化定位

4 讨论

本论文的创新之处

参考文献

致谢

博士在读期间发表学术论文

附表：产气荚膜梭菌淡水鱼分离株毒素基因核苷酸序列

山东省四大湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌毒素型调查及致病机理研究

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