基于核酸适配体的生物传感器的研究

论文摘要

蛋白质是生物体内含量最高,功能最重要的生物大分子。常规的蛋白质检测方法一般是基于传统的抗原-抗体之间的免疫反应进行的,由于抗原和抗体之间的特异性反应,免疫传感器具有很好的专一性和选择性。然而,近年来以适配体作为识别元件的蛋白质检测技术越来越受到人们的关注。适配体（aptamer）一词来源于拉丁语aptus,即to fit,适合的意思。核酸适配体是一类通过SELEX技术体外筛选而获得的,对蛋白质有很好的识别能力,核酸适配体对蛋白质的亲和力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美,解离常数通常在纳摩尔到皮摩尔之间,且与抗体相比具有许多优越性.如核酸适配体是体外人工化学合成,合成简单,稳定性、重现性好,容易修饰,可以按需要对序列中的核苷酸定点标记各种官能团和报告基团,如荧光基团,各种酶,电活性物质等。便于核酸适配体的固定化和信号的检测,检测目标广泛等。本文基于核酸适配体的上述优点,在传统的免疫传感器的基础上,构建了一系列适配体生物传感器。具体内容如下:（1）在第二章中报道了一种无标记电化学方法来检测凝血酶。在这个工作中,我们引进了一种新的夹心电化学方法,采用抗体作为捕获探针,适配体作为检测探针,亚甲基兰作为电活性物质嵌入适配体中来获取电信号,不需要对探针进行任何修饰,传感器对凝血酶的线性响应范围是1-60nM,检测下限是0.5nM。（2）在第二部分的夹心模式的基础上,在第三章中,报道了一种基于适配体的酶放大方法来检测免疫球蛋白E（IgE）。生物素化抗IgE适配体作为检测探针,亲和素标记的碱性磷酸酯酶与电极表面的适配体上的生物素相连,碱性磷酸酯酶催化抗坏血酸磷酸酯水解成强还原剂抗坏血酸,将溶液中的银离子还原成银单质,沉积到电极表面。沉积的银的量与电极表面固定的IgE成正比,用溶出伏安法来定量。（3）在第四章中报道了一种基于目标物诱导适配体置换技术的无标记电化学检测方法,用来检测腺苷。利用适配体与目标物的强亲和力,将电极表面与捕获探针杂交的互补链置换下来,使嵌入在双链中的电活性物质亚甲基兰量减少,从而使得电信号发生变化。（4）在第五章里,我们用一种简单的荧光方法来检测IgE,通过荧光基团标记的适配体与目标物先反应一段时间,再将淬灭基团标记的适配体的互补链（QDNA）与之反应,检测反应前后的荧光强度,通过强度的减弱程度来对IgE定量。此方法检测蛋白质的线性范围宽,下限低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪言
• 1.1 适配体的筛选技术－SELEX 技术
• 1.2 适配体的优点及其与靶物质的作用原理
• 1.3 适配体生物传感器
• 1.3.1 光学适配体生物传感器
• 1.3.2 电化学适配体传感器
• 1.3.3 压电适配体传感器
• 1.4 适配体分子的固定
• 1.4.1 自组装法
• 1.4.2 电化学富集法
• 1.4.3 亲和交联法
• 1.4.4 共价键合法
• 1.5 本文工作设想
• 第2章 基于适配体和抗体的电化学凝血酶检测
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.3 纳米金-壳聚糖复合膜的制备
• 2.2.4 免疫传感界面的构建
• 2.2.5 电化学检测凝血酶
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 优化和表征纳米金-壳聚糖复合膜
• 2.3.2 离子强度对适配体与凝血酶结合能力的影响
• 2.3.3 电极的响应性能
• 2.4 小结
• 第3章 基于适配体酶放大的电化学免疫传感器
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.3 抗体在金电极表面的固定
• 3.2.4 基于生物素化适配体识别和酶催化放大的免疫分析
• 3.2.5 电化学检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 电化学免疫传感器的原理
• 3.3.2 试验条件的优化
• 3.3.3 免疫传感器的分析性能
• 3.4 小结
• 第4章 基于目标物诱导适配体置换技术对纳摩尔级腺苷的无标记电化学检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.3 20nm 金纳米颗粒的制备
• 4.2.4 传感界面的制备
• 4.2.5 试样的电化学检测与传感界面的再生
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 修饰电极的电化学特性
• 4.3.2 固定化界面
• 4.3.3 试验条件的优化
• 4.3.4 腺苷检测的灵敏度与选择性
• 4.3.5 传感界面的再生性与稳定性
• 4.4 小结
• 第5章 基于目标IGE 竞争结合的荧光传感器
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂与仪器
• 5.2.3 实验步骤
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 传感系统对待测物的响应
• 5.3.2 传感系统的选择性
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录