鲁西黄牛瘤胃高效降解纤维素机制初步研究

论文摘要

生物质能源的开发与利用是当今世界各国普遍关注的热点问题。牛等反刍动物的瘤胃是已知最高效的天然纤维素降解系统之一。鲁西黄牛是山东省特有的优良畜牧品种,对干草、秸秆等粗饲料的消化能力强。深入研究鲁西黄牛瘤胃共生微生物高效降解纤维素的机制,可能会为推动生物质能源大规模产业化这一远景目标的实现提供新思路。在本论文中,我们发现鲁西黄牛瘤胃液具有降解半纤维素、游离纤维素和结晶纤维素底物的能力。与可高效降解纤维素的丝状真菌拟康氏木霉S38固体发酵粗酶液相比,瘤胃液单位蛋白浓度的纤维素内切酶活力更高。瘤胃液中纤维素内切酶的最适温度为50℃,最适pH值为6.0；半纤维素酶的最适温度为40～45℃,最适pH值为5.0。通过改进的活性电泳技术,进一步发现瘤胃液中至少存在10种木聚糖酶、12种纤维素内切酶、1种纤维素外切酶和2种p-葡萄糖苷酶组分。通过观察鲁西黄牛瘤胃原位降解的CF11纤维素粉等纤维素底物的超微结构发现,被降解的CF11纤维素粉表面会出现明显的凹槽,凹槽的底部会出现孔洞。表面凹槽的宽度与黄色瘤胃球菌的直径接近。利用纤维素酶对底物的吸附作用和分子筛柱层析技术,从瘤胃食糜中初步分离得到一种大分子量、高质荷比且兼具多种糖苷水解酶活性的组分,这些性质都与已经报道过的厌氧细菌产的纤维小体相似。但脱离了菌体的纤维小体富集液,尽管表现出很高的CMCase酶活,却对结晶度较高的纤维素底物（如CF11纤维素粉和滤纸）的降解能力下降,底物表面也看不到明显的凹槽和孔洞结构。基于这些结果,我们认为鲁西黄牛瘤胃系统具有高效降解高结晶度的天然纤维素底物的能力。推测这一高效机制首先依赖于其瘤胃中共生微生物所产的多种糖苷水解酶,尤其是瘤胃球菌产的大分子量兼具多种糖苷水解酶活的纤维小体。并且,瘤胃球菌可能通过滚动的方式,利用其表面的纤维小体打破结晶纤维素链,进而逐步降解天然纤维素底物。瘤胃球菌-纤维小体复合体对降解结晶纤维素可能是必须的,脱离了菌体的纤维小体将丧失大部分降解天然纤维素的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写符号
• 第1章 绪论
• 1.1 纤维素与纤维素酶
• 1.1.1 天然纤维素与细胞壁
• 1.1.2 纤维素降解微生物
• 1.1.3 纤维素酶
• 1.2 降解纤维素的超分子机器—纤维小体
• 1.2.1 纤维小体的一般组装模式
• 1.2.2 粘连模块
• 1.2.3 对接模块
• 1.2.4 粘连模块和对接模块相互作用
• 1.2.5 催化组分
• 1.2.6 CBM
• 1.2.7 纤维小体超分子复合体组装模式的多样性
• 1.3 瘤胃中厌氧微生物的纤维素酶系统
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）
• 1.3.3 白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）
• 1.3.4 产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）
• 1.3.5 瘤胃真菌（Rumen fungi）
• 1.4 立题依据
• 第2章:鲁西黄牛瘤胃液糖苷水解酶系性质的初步分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器试剂
• 2.1.3 瘤胃液的提取
• 2.1.4 瘤胃液糖苷水解酶活的测定
• 2.1.5 瘤胃液酶学性质的研究
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 通过瘘管获取牛瘤胃内容物
• 2.2.2 瘤胃液糖苷水解酶活力及其动态变化
• 2.2.3 瘤胃液与拟康氏木霉S38粗酶液纤维素酶活力对比
• 2.2.4 反应温度对瘤胃液糖苷水解酶活力的影响
• 2.2.5 pH值对瘤胃液糖苷水解酶活力的影响
• 2.3 总结与讨论
• 第3章:鲁西黄牛瘤胃液糖苷水解酶多样性的快速展示
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器试剂
• 3.1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.4 CMC活性电泳
• 3.1.5 木聚糖活性电泳
• 3.1.6 纤维素外切酶活性电泳
• 3.1.7 糖苷酶活性电泳
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 鲁西黄牛瘤胃液SDS电泳
• 3.2.2 鲁西黄牛瘤胃液活性电泳条件探索
• 3.2.3 活性电泳快速展示瘤胃液糖苷水解酶谱
• 3.2.4 瘤胃液糖苷水解酶谱的动态变化
• 3.2.5 活性电泳展示瘤胃液纤维素内切酶组分的性质
• 3.3 总结与讨论
• 第4章:鲁西黄牛瘤胃原位降解纯纤维素底物超微结构观察
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 仪器试剂
• 4.1.3 纯纤维素底物的原位降解
• 4.1.4 底物结构变化宏观量的测定
• 4.1.5 超微结构观察
• 4.1.6 数字化图像定量数据的提取
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 CF11在牛瘤胃原位降解过程中的结构宏观变化
• 4.2.2 SEM观察原位降解过程中CF11的表面结构变化
• 4.2.3 AFM观察原位降解过程中CF11的表面结构变化
• 4.2.4 SEM观察原位降解过程中滤纸和脱脂棉的表面结构变化
• 4.3 总结与讨论
• 第5章:鲁西黄牛瘤胃液纤维小体的富集和初步分离纯化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器试剂
• 5.1.3 从瘤胃食糜中富集纤维小体
• 5.1.4 Sephacryl S-200 HR分子筛柱层析初步分离纤维小体
• 5.1.5 CMC酶活的测定
• 5.1.6 活性电泳
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 对食糜样品中纤维小体的富集
• 5.2.2 富集过程中的纤维素酶活变化
• 5.2.3 对食糜样品中纤维小体组份的初步分离
• 5.2.4 活性电泳展示经初步分离的纤维小体组份
• 5.3 总结与讨论
• 第6章:纤维小体富集液降解纯纤维素底物超微结构观察
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 仪器试剂
• 6.1.3 纤维小体富集液降解纯纤维素底物
• 6.1.4 底物结构变化宏观量的测定
• 6.1.5 超微结构观察
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 CF11被纤维小体富集液降解过程中的宏观结构变化
• 6.2.2 SEM观察纤维小体富集液降解过程中CF11的表面结构变化
• 6.2.3 SEM观察纤维小体富集液降解过程中滤纸的表面结构变化
• 6.3 总结与讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表