人三叶因子3基因的合成及转化番茄的研究

论文摘要

三叶因子3（trefoil factor 3, TFF3）属三叶肽家族,是近年来被人们注意到的对肠道黏膜具有重要保护和修复作用的新型生长因子类多肽物质,因其分子中含有一个特征性三叶结构而得名。它结构稳定,不被多种消化酶破坏,能抗酸、抗蛋白酶和抗热分解,在消化道内能保持结构及功能上的完整。 套叠PCR技术又称重叠区扩增基因拼接法（gene splicing by overlap extension, gene SOEing）是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变。根据hTFF3的全长合成了4个单链片段用于合成hTFF3基因,经两次连接反应后,测序结果表明获得了正确的hTFF3基因全长183bp的序列。 植物生物反应器具有能准确表达和正确组装重组蛋白、生产成本低、生产方式简单、可以稳定大量生产、安全等优点,因此利用植物生物反应器表达药用蛋白具有广阔的研究和应用前景。 本研究采用番茄作为生物反应器来表达重组hTFF3,构建了含组成型启动子CaMV35S的植物表达载体pBTF。利用农杆菌介导法,转化番茄叶盘,经卡那霉素（Kan）多重筛选,共获得8株抗性植株。PCR分析结果为阳性的植株有7株。对其进行的结果显示,hTFF3基因已经与CaMV35S、Npt Ⅱ一起整合到了番茄基因组中。对Southern blot分析阳性植株进行RT-PCR分析证明,hTFF3基因在启动子CaMV35S的作用下在叶片有转录水平的表达。 本研究利用植物生物反应器表达重组hTFF3,以期获得适用于口服的重组hTFF3蛋白,为胃肠疾病的治疗开辟一条新的途径。

论文目录

• 引言
• 1 三叶因子的结构与功能
• 1.1 HTFF3的概况
• 1.2 HTFF3的结构
• 1.3 HTFF3的功能
• 1.4 HTFF3的作用机制及相关信号传导
• 1.5 研究展望
• 2 利用植物生物反应器生产药用蛋白
• 2.1 植物生物反应器的优点
• 2.1.1 准确表达、正确组装重组蛋白质
• 2.1.2 稳定、大量地生产转基因产品
• 2.1.3 安全性
• 2.2 几种常用的生产重组蛋白质的植物表达系统
• 2.2.1 植物细胞基因组的遗传转化
• 2.2.2 植物病毒表达载体
• 2.3 用转基因植物生产疫苗
• 2.4 用转基因植物生产重组抗体
• 2.5 用转基因植物生产重组人类防御素
• 2.6 植物生物反应器发展前景
• 3 本研究的目的和意义
• 4 技术路线
• 材料与方法
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 常用酶和生化试剂
• 1.2.1 分子生物学常用酶及试剂盒
• 1.2.2 分子生物学常用生化试剂
• 1.3 植物材料
• 1.4 培养基
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 基因合成
• 2.1.1 单链片段的合成
• 2.1.2 利用高保真DNA聚合酶合成2个亚片段
• 2.1.3 连接产物回收
• 2.1.4 引物的合成
• 2.1.5 PCR连接
• 2.1.6 PCR产物回收
• 2.1.7 反应产物末端加A
• 2.1.8 扩增产物的克隆
• 2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.1 pBTF中间表达载体的构建
• 2.2.1.1 切除GUS基因的线性化pBI121载体的制备
• 2.2.1.2 线性化载体与hTFF3基因片段的连接
• 2.2.1.3 pBTF重组载体的鉴定
• 2.3 重组农杆菌介导的番茄遗传转化
• 2.3.1 重组农杆菌工程菌株的构建
• 2.3.2 重组农杆菌介导的番茄遗传转化
• 2.3.2.1 播种
• 2.3.2.2 Kan抗性敏感试验
• 2.3.2.3 农杆菌侵染液的制备
• 2.3.2.4 叶盘法转化番茄
• 2.3.2.5 抗性愈伤组织筛选及出芽诱导
• 2.3.2.6 转化植株的诱根培养
• 2.4 转基因番茄植株检测
• 2.4.1 PCR
• 2.4.2 Southern blot
• 2.4.3 RT-PCR
• 结果与分析
• 1 HTFF3基因的合成
• 1.1 PCR连接反应
• 1.2 连接反应中酶的选择
• 2 pBTF植物表达载体的构建与鉴定
• 3 重组农杆菌工程菌株
• 3.1 农杆菌电激转化
• 3.2 重组农杆菌工程菌鉴定
• 4 番茄遗传转化
• 4.1 农杆菌侵染液浓度及侵染时间对转化的影响
• 4.2 番茄转化植株的筛选
• 4.3 转基因番茄植株检测
• 4.3.1 PCR检测
• 4.3.2 Southern blot
• 4.3.3 RT-PCR检测
• 讨论
• 1 基因合成的方法
• 2 套叠PCR法在合成HTFF3基因中的应用
• 1.1 反应程序设计
• 1.2 反应中酶的选择
• 1.3 反应产物的克隆
• 3 农杆菌侵染液浓度及侵染时间对转化的影响
• 4 HTFF3口服给药的可行性
• 5 转基因植物生产药用蛋白存在的问题
• 6 本研究的后续工作
• 结论
• 参考文献
• 致谢