论文摘要
目的构建pMD18-T-hTERT重组质粒作为标准品,建立SYBR Green实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）方法检测肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者血浆人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）DNA水平,并分析其临床意义。方法1.建立血浆DNA的提取方法,并经常规PCR扩增目的基因hTERT,确认血浆DNA提取成功。以人基因组DNA为模板,常规PCR扩增hTERT基因片段,纯化回收扩增产物,与pMD18-T载体连接构建重组质粒作为定量检测的标准品,并经PCR扩增和测序鉴定。设计针对hTERT DNA的引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测血浆hTERT DNA,并进行方法学评价（包括不精密度、特异性和线性范围）。2.收集60例HCC患者术前血浆及对应的临床资料,21例乙型病毒性肝炎（hepatitis B virus,HBV）患者及29例健康体检者血浆作对照。提取血浆DNA,利用建立的FQ-PCR方法定量检测各组血浆hTERT DNA水平,分析血浆hTERT DNA水平对HCC的诊断效率,以及与HCC患者临床特征之间的关系。同时,检测19例术后患者血浆hTERT DNA水平,并与术前水平进行比较。结果1.血浆DNA的提取和FQ-PCR方法的建立及评价:①成功建立血浆DNA的提取方法。②成功构建重组质粒pMD18-T-hTERT,经PCR扩增和测序鉴定与预期结果一致。③FQ-PCR的最优反应体系为:SYBR Premix Ex Taq （2×）10.0μl,上、下游引物（10μM）分别为0.8μl,ROX reference dye II 0.4μl,模板2.0μl,双蒸水（ddH2O）6.0μl,共20.0μl。最佳反应条件为:95℃预变性10 s,95℃变性5 s,60℃退火34 s,共40个循环;该方法不精密度较小（批内及天间变异系数分别为0. 86%和1. 44%）,特异性高,线性范围较宽（103～108 copies /μl）。2.血浆hTERT DNA与HCC患者临床特征及实验室指标的关系分析:①HCC患者血浆hTERT DNA水平{（4.18×104±4.94×104）copies/μl}显著高于HBV患者{（1.44×104±6.61×103）copies/μl}和健康对照{（1.21×104±6.63×103）copies/μl},差异有统计学意义（P<0.01）。②ROC曲线显示,以1.87×104 copies/μl为截断值时,诊断HCC的灵敏度和特异性分别为64%和90%。③HCC患者血浆hTERT DNA水平与肿瘤直径、TNM分期、门静脉癌栓及血清AST水平密切相关（P<0.05）,与淋巴结转移、外周血白细胞数、血清AFP及ALT水平无关（P>0.05）;另外,TNM分期Ⅰ-Ⅱ期及血清AFP≤20 ng/ml的HCC患者血浆hTERT DNA水平显著高于HBV患者及健康对照（P<0.05）。④检测19例术后患者血浆hTERT DNA水平,与术前相比显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论成功建立了血浆DNA的提取方法,并以重组质粒pMD18-T-hTERT为标准品,成功建立了FQ-PCR检测血浆hTERT DNA的方法。HCC患者血浆hTERT DNA水平显著高于HBV患者和健康对照,并与肿瘤直径、TNM分期、门静脉癌栓和血清AST水平高度相关。FQ-PCR检测血浆hTERT DNA水平有望成为临床HCC早期筛查及病情监测的重要工具。