三角帆蚌肝脏消减cDNA文库的构建与分析

论文摘要

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是中国特有的最主要的淡水育珠蚌种。三角帆蚌瘟病是严重危害淡水珍珠生产的传染性蚌病,该病传染快、死亡率高、治疗难度大。20世纪80年代开始的三角帆蚌瘟病病原相关研究一直存在病毒与细菌两类病原的报道。本研究以2005年9月采集的三角帆蚌瘟病典型症状病蚌为基本材料,为探索三角帆蚌瘟病的抗病育种技术途径与方法,应用抑制性消减杂交技术（SuppressionSubtractive Hybridization,SSH）,建立了三角帆蚌肝脏cDNA文库,筛选分析三角帆蚌瘟病的免疫相关因子。1.三角帆蚌肝脏消减cDNA文库构建采用抑制性消减杂交技术,构建了健康三角帆蚌和抗病三角帆蚌（攻毒后健康存活者）肝脏的消减cDNA文库,随机挑取300个cDNA克隆进行了单向测序,共获得有效cDNA序列214个。2.三角帆蚌肝脏消减cDNA文库序列分析序列同源性搜索结果显示,在214个有效cDNA序列中,有120个克隆和GenBank中的已知功能的序列具有较高的同原性（E值＜-6）;30个则与未知功能的开放阅读框具有较高的相似性,称之为假定蛋白;21个序列则没有任何相似的序列,很有可能是以前没有鉴定过的EST序列或是5’-或3’-UTR序列。214个已知功能的EST分别属于98个不同的基因,均为三角帆蚌的首次报道。根据Adams对功能基因的分类方法,所获得EST分为8类:细胞分裂相关、细胞结构与运动相关、代谢相关、信号传导相关、细胞防疫相关、基因与蛋白表达相关、其它功能蛋白和未知功能蛋白等。其中细胞防御等免疫相关因子序列的克隆数达40个,占总克隆数的18.2%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 三角帆蚌瘟病的研究
• 1.3 SSH技术与贝类免疫相关因子
• 1.3.1 SSH技术
• 1.3.2 贝类动物免疫特性及免疫相关因子
• 1.4 论文研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 接头和引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 动物材料处理
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 MRNA的分离纯化
• 2.2.4 抑制性消减杂交（SSH）
• 2.2.5 消减EDNA文库的构建
• 2.2.6 单克隆的挑选和培养
• 2.2.7 消减cDNA片段的初步鉴定
• 2.2.8 序列加工及比较分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取及MRNA的纯化
• 3.2 双链CDNA合成和RSAⅠ酶切效率
• 3.3 SSH产物的2次PCR扩增结果
• 3.4 接头连接效率检测
• 3.5 消减杂交效率检测
• 3.6 PCR检测消减文库质量
• 3.7 消减CDNAEST序列的统计与分析
• 3.8 消减EDNAEST功能的分类
• 4 讨论
• 4.1 构建消减CDNA文库的材料选择与处理
• 4.2 消减CDNA文库的构建
• 4.3 消减CDNA文库EST的分析
• 4.4 消减CDNA文库中免疫基因的分析
• 5 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介