金银花黄酮活性成分分离纯化与生物学效应研究

论文摘要

金银花为常用的传统中草药,功能清热解毒,临床上主要治疗细菌感染、感冒等症。现代药理研究显示金银花中主要化学成分有黄酮类、有机酸类、苷类及挥发油等。其中苷类中三萜皂苷类成分主要与金银花保肝利胆作用有关,而以绿原酸为主的有机酸类化合物和挥发油被认为与其抗菌活性相关。但金银花黄酮是其组成中仍未经充分药理学研究的成分,其相关的生物学活性研究甚少。对其它植物药黄酮的研究提示,该类成分多具有抗菌和抗氧化作用,因此本研究在国家自然科学基金的支持下,对金银花中黄酮类物质进行分离纯化,并考察其生物学效应,为说明金银花发挥药理作用的机制奠定实验基础。第一部分金银花总黄酮的分离纯化及抑菌活性考察一、实验方法:1.金银花总黄酮的提取金银花总黄酮以醇提法提取,并采用均匀设计对提取条件进行优化。2.金银花总黄酮初步分离及抑菌活性考察金银花总黄酮浸膏以DM130型大孔吸附树脂柱采用不同浓度乙醇（0,20%,40%,60%）梯度洗脱进行初步分离,对获得的分离组分按A、B、C等依序命名。微量稀释法考察各分离组分对金黄色葡萄球菌（n=7）、肺炎克雷伯菌（n=5）、大肠杆菌（n=6）、铜绿假单胞菌（n=4）等细菌的MIC值。3.金银花黄酮组分分离纯化及抑菌活性考察对方法2中分离所得且体外抑菌活性较好的黄酮组分采用制备型HPLC分离制备,对制备组分按A1、A2、…B1、B2等依序命名,并采用微量稀释法考察各制备组份对金黄色葡萄球菌（n=7）、肺炎克雷伯菌（n=5）、大肠杆菌（n=6）、铜绿假单胞菌（n=4）等细菌体外抑菌活性。4.金银花黄酮抑菌活性成分结构鉴定对方法3中制备所得且体外抑菌活性较好组分采用HPLC分离提纯,并对纯化分离所得纯度较高单一成分进行LC-MS、1H NMR、13C NMR等鉴定。二、实验结果:1.金银花总黄酮醇提法最佳提取工艺为:在10g金银花粉末（60目）中加入10倍体积50%乙醇溶液于90℃条件下提取1h。2.金银花总黄酮浸膏经大孔吸附树脂柱分离后共收集到5组含有黄酮的洗脱液（0%洗脱组分按洗脱液的澄清与否分为A、B两组分;C为20%洗脱组分,D为40%洗脱组分,E为60%洗脱组分）,各分离的洗脱组分对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌均有抑制作用,组分B、C抑菌作用优于其他组分,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA）的MIC值均≤4 mg·mL-1。3. B组分经HPLC初步纯化制备共获得6个组分（B1～B6）、C组分共获得2个组分（C1～C2）,其中C2组分抑菌效果较好且稳定,对MRSA的MIC值≤2 mg·mL-1。4. C2组分经HPLC进一步分离纯化,得到一纯度较高单一化合物,经LC-MS、1H NMR、13C NMR等进行结构鉴定为金丝桃苷。第二部分金丝桃苷体外抑菌活性的研究一、实验方法:1.金丝桃苷体外抑菌活性初步考察微量稀释法考察金丝桃苷对金黄色葡萄球菌（n=7）、肺炎克雷伯菌（n=5）、大肠杆菌（n=6）、铜绿假单胞菌（n=4）等细菌的体外抑菌活性。2.金丝桃苷与抗菌药物联用后对金黄色葡萄球菌体外抑菌活性考察采用棋盘法考察金丝桃苷与β-内酰胺类及喹诺酮类抗菌药物联用后对金黄色葡萄球菌（n=20）抑菌活性,计算FIC值。3.金丝桃苷与绿原酸联用后体外抑菌活性考察棋盘法考察金丝桃苷与绿原酸联用后对金黄色葡萄球菌（n=7）、肺炎克雷伯菌（n=5）、大肠杆菌（n=6）、铜绿假单胞菌（n=4）等细菌的抑菌活性,计算FIC值。4.金丝桃苷对金黄色葡萄球菌粘附能力的影响采用半定量粘附法从20株金黄色葡萄球菌中筛选具有较强粘附能力的菌株;再对所筛选出的细菌采用粘附抑制实验考察不同浓度（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5mg.mL-1）金丝桃苷对其粘附能力的影响。5.金丝桃苷对金黄色葡萄球菌NorA外排泵的影响采用携带NorA基因的金黄色葡萄球菌SA26592（pUT-norA）菌株为工具菌,通过PCR扩增的方法确认该菌株携带NorA基因。采用微量稀释法考察金丝桃苷与常用喹诺酮类药物联用后对金黄色葡萄球菌SA26592（pUT-norA）菌株的抑菌活性。二、实验结果:1.金丝桃苷对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用最强,MIC为0.5～1mg·mL-1,对大肠杆菌,铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌作用相当,均为2 mg·mL-1。2.金丝桃苷与β-内酰胺类及喹诺酮类抗菌药物联用,对20株金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果显示,金丝桃苷与苯唑西林钠、青霉素钠、加替沙星和左氧氟沙星联用后,表现为相加作用的菌株分别占55%、30%、25%和15%。表明金丝桃苷与β-内酰胺类及喹诺酮类抗菌药物存在一定的联用效果。3.金丝桃苷与绿原酸联用,仅对铜绿假单胞菌ATCC27853菌株表现为明显的相加作用（FIC为0.75）,其余多表现为无关作用。4.金丝桃苷浓度低于MIC时（<0.5mg.mL-1）,不能抑制金黄色葡萄球菌的生长,对其粘附能力亦无明显影响。5. SA26592（pUT-norA）菌株药敏结果显示,该菌株对新霉素、卡那霉素耐药,对其它抗生素敏感。SA26592（pUT-norA）菌株对环丙沙星、氧氟沙星等亲水性喹诺酮类药物的MIC,较之于司帕沙星等疏水性喹诺酮类药物增加了3264倍。6.金丝桃苷在1/2 MIC浓度时（0.25mg·mL-1）,能显著降低环丙沙星、氧氟沙星等亲水性喹诺酮类药物对SA26592（pUT-norA）菌株的MIC值,而对疏水性喹诺酮类药物影响不大。第三部分金丝桃苷对CCl4诱导肝损伤模型的保护作用实验研究一、实验方法:1.确定CCl4诱导L-02人肝细胞损伤的最佳浓度在L-02人肝细胞培养液中加入不同浓度（2.5,5,10,15,20,30mM）的CCl4,MTT法检测存活率,确定CCl4诱导肝细胞损伤的最佳浓度。2.金丝桃苷对CCl4诱导L-02人肝细胞损伤的影响向肝细胞培养液中加入CCl4及不同浓度金丝桃苷（5～160μg·mL-1）,用MTT比色法检测细胞存活率;用赖氏法检测培养上清中ALT、AST含量;裂解细胞后,用硫代巴比妥酸法检测MDA含量,用比色法检测GSH水平。3.金丝桃苷对CCl4诱导大鼠急性肝损伤模型的保护作用成年雄性SD大鼠36只随机分为6组（每组6只）,①正常对照组、②CCl4损伤组、③金丝桃苷组（30 mg·kg-1）、④～⑥金丝桃苷+CCl4组（金丝桃苷剂量分别为10 mg·kg-1, 20 mg·kg-1, 30 mg·kg-1）。①和②给予生理盐水、③给予金丝桃苷30 mg·kg-1、④～⑥给予设定剂量的金丝桃苷,连续灌胃三天,于末次给药后6h灌胃给予1.25 mL·kg-1 CCl4液致急性中毒。24h后断颈处死所有大鼠,收集大鼠血液及肝脏组织进行检测。4.大鼠生化指标检测用赖氏法检测大鼠血清中ALT、AST含量;肝脏组织中MDA、GSH及8-OHdG水平检测分别采用硫代巴比妥酸法、比色法及ELISA法。5.病理检查取大鼠肝脏组织常规HE染色,光学显微镜下观察。二、实验结果:1. CCl4浓度为15mM时为肝细胞损伤模型最理想的造模浓度。2.金丝桃苷5、10、20、40、80、160μg·mL-16个剂量组中, 80μg·mL-1剂量组肝细胞保护作用显著,明显降低ALT、AST、MDA含量,抑制GSH水平降低,且光镜下细胞结构未见明显损伤,MTT结果显示肝细胞存活率增加。3.金丝桃苷10 mg·kg-1, 20 mg·kg-1, 30 mg·kg-1剂量组均有一定肝保护效应,肝脏组织病理检查和各项生化指标与模型组比较均有明显改善（p<0.05）,其中30 mg·kg-1剂量组各项生化指标与正常对照组最接近。4.金丝桃苷组（30 mg·kg-1）连续灌胃三天对大鼠肝脏无明显毒性。全文结论1.金银花中黄酮类物质具有较强的抗菌活性,其中金丝桃苷具有较强的体外抑菌作用,特别是对MRSA作用明显,MIC达0.5 mg.mL-1。因此金银花黄酮应成为评价金银花抗菌活性的重要指标。2.金丝桃苷与β-内酰胺类及喹诺酮类抗菌药物合用,对临床常见致病菌部分菌株有一定增效作用。3.金丝桃苷浓度低于MIC时（<0.5mg.mL-1）,对金黄色葡萄球菌的粘附能力无明显影响。但能显著增强环丙沙星、氧氟沙星等亲水性喹诺酮类药物对多药外排耐药菌株SA26592（pUT-norA）的抗菌作用,而对疏水性喹诺酮类药物影响不大。4.金丝桃苷能明显减轻CCl4诱导的L-02肝细胞株的损伤,显著降低ALT、AST、MDA水平,增加GSH水平,增加细胞存活率。5.金丝桃苷对于CCl4诱导的SD大鼠急性肝损伤具有保护效应,组织学和各项生化指标均有明显改善（p<0.05）,其中30 mg·kg-1剂量组各项生化指标已接近正常。

论文目录

• 英文缩写索引
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 金银花黄酮活性成分分离纯化及生物学效应研究
• 前言
• 第一部分 金银花总黄酮的分离纯化及抑菌活性考察
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 金丝桃苷体外抑菌活性考察
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 金丝桃苷对CC14诱导肝损伤模型的保护作用实验研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 金银花化学成分及其药理作用的研究进展
• 参考文献
• 博士在读期间论文发表情况
• 拟发表英文论著