一、hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征（论文文献综述）
宗利[1]（2021）在《自给自足型P450单加氧酶的发现、表征、改造及应用》文中指出细胞色素 P450 单加氧酶（Cytochrome P450monooxygenases,CYPs）是一种普遍存在于真核生物、古细菌、细菌和病毒的血红素依赖的单加氧酶超家族,CYPs可在各种底物上实现生物转化反应,包括羟基化、脱羧、环氧化、还原脱卤、脱烷基、亚砜化和反马氏氧化等。CYPs介导的脂肪酸羟化反应是化学合成羟基脂肪酸（HFAs）的绿色替代方案,羟基脂肪酸是一种高价值的油脂化学品,在材料工业和医疗领域有着广泛的应用。虽然许多CYPs需要额外的还原酶蛋白的存在来实现催化活性,但自给自足的CYPs可以将其还原酶伙伴融合到催化区域中,从而大大的简化了生物转化过程。然而,大多数CYPs的热稳定性差以及有限的区域选择性是限制其应用的主要缺陷。因此,获得性能优良和新型区域选择性的CYPs具有重要的研究价值。本论文通过基因组挖掘技术从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens DSM 7）中获得2个新型自给自足型CYP102家族细胞色素P450单加氧酶,分别命名为Bamf2522和Bamf0695。采用全细胞催化的方式探究了它们对不同脂肪酸的区域选择性催化能力,并对其酶学性质进行了表征。此外,通过对Bamf2522和Bamf0695进行同源建模及理性、半理性设计获得了一系列对脂肪酸区域选择性发生改变的突变体。通过分子对接分析了部分突变体催化脂肪酸区域选择性改变的可能原因。最后本研究初步探究了 Bamf2522和Bamf0695对可再生资源微藻中脂肪酸混合物的催化效果。本论文主要研究内容和结果如下:1.借助于基因组数据库挖掘技术,基于实验室现有菌种资源,以来自于巨大芽孢杆菌中的自给自足型P450BM3（CYP102A1）的氨基酸序列为模板,挖掘到了两个来自于同一细菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 7的新型CYP,分别命名为Bamf2522和Bamf0695。通过序列比对和进化树分析,发现它们均属于CYP102A亚家族。通过对不同链长的脂肪酸的催化研究,发现Bamf2522和Bamf0695对脂肪酸的羟基化反应表现出不同的区域选择性倾向,Bamf0695倾向于在大多数脂肪酸的亚末端ω-1,ω-2和ω-3位发生羟基化反应,而Bamf2522在催化脂肪酸时表现出更广泛的产物多样性,特别是在催化棕榈酸时,能够在其碳链的ω-1～ω-7位点上进行羟基化,使其成为目前唯一一种能对棕榈酸的ω-6和ω-7位点进行羟基化反应的野生型CYP102家族成员酶。2.通过对Bamf2522和Bamf0695进行光谱学性质表征,发现这两种酶通入一氧化碳气体后在450 nm波长下均具有明显的吸收峰。表明这两种酶可能具有P450单加氧酶的酶学活性。进一步探究这两种酶的最适温度、pH和热稳定性,发现Bamf2522的最适温度为30℃,最适pH为7.0。Bamf0695的最适温度为35℃,最适pH为7.5。热稳定性研究结果表明,在温度为50℃时,Bamf0695仍具有良好的热稳定性。因此,Bamf0695更具有工业应用潜力。3.本研究基于氨基酸序列比对、同源建模和分子对接分析,对Bamf0695底物结合口袋内的活性位点氨基酸残基F89、1266、和A331进行定点突变。通过对一系列脂肪酸底物谱测定后发现,A331V和F89I单点突变对棕榈酸的区域选择性没有改变,而A331V/F89I双位点的叠加使棕榈酸ω-1位的产物从野生酶的31%增加到61%。表明这两个氨基酸之间的相互作用影响了对棕榈酸的区域选择性。通过对A331位点进行饱和突变获得的突变体A331I,其在催化月桂酸和棕榈酸时产生的ω-1位的HFAs占总产物的比例高达81.9%和89.6%,具有高度区域选择专一性。此外,其他突变体催化C12～C18直链脂肪酸羟化时也能够在脂肪酸的亚末端位置达到超过50%的区域选择性。使其成为生产纯羟基脂肪酸的良好候选酶。为了探究脂肪酸区域选择性改变的可能原因,本文以突变体A331V/F89I为研究对象,选用棕榈酸作为配体分子,通过将野生酶和突变体分别与棕榈酸进行分子对接,对接后的结果显示,与野生酶相比,突变导致棕榈酸ω-1位碳原子距离血红素铁催化中心的距离更近。推测A331V和F89I位点的叠加效应导致棕榈酸的羟化产物向ω-1位点偏移。4.基于文献对P450 BM3（CYP102A1）的研究以及结合Bamf2522同源建模的结构分析,本研究除了对Bamf2522活性位点氨基酸F89、1266和A331进行了定点突变外,还引入了位于血红素结构域远端的热点残基S49、F53、N72、M187、V218和M240。通过对单个位点或多个位点组合突变探究了其对脂肪酸区域选择性的影响。结果表明单点突变体F891催化棕榈酸时使脂肪酸的羟基化产物由野生酶的ω-1～ω-7拓宽到ω-1～ω-9。Bamf2522的一些突变体对脂肪酸链内位置的区域选择性（ω-4～ω-9）也有很大提高,特别是含有6个突变位点的突变体 R41（A331V/F89I/N72S/M187T/V218A/M240L）催化棕榈酸时产生的ω-7、ω-8和ω-9 HFAs之和占总产物的84%,实现了高度链内HFAs的富集。这是迄今为止观察到的自给自足型CYP的最高链内选择性。同样,为了探究脂肪酸区域选择性改变的原因,将野生酶和突变体F89I分别与棕榈酸进行分子对接,结果显示,与野生酶相比,突变导致棕榈酸ω-8和ω-9位距离血红素铁催化中心的距离更近,这可能是催化棕榈酸区域选择性改变的原因。5.为了探究CYPs对可再生资源中的脂肪酸的催化性能,以期扩大CYPs催化脂肪酸底物的来源,本文以微藻脂肪酸提取物作为Bamf2522和Bamf0695的催化底物进行反应,结果表明,Bamf0695能够将复杂的微藻提取物中的脂肪酸转化为高价值的HFAs,而Bamf2522没有表现出相应的酶活性。简言之,本研究发现的Bamf2522和Bamf0695及其突变体在绿色和可持续生产多种高价值羟基脂肪酸方面具有应用潜力。
任佳楠[2]（2021）在《Massilia sp. UMI-21 PHA合成途径中相关酶鉴定及其对PHA合成的影响》文中认为聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHAs）是由多种微生物在碳源过量且一些营养条件被限制的情况下于细胞内积累的可作为能量储存物质的聚合羟基烷酸酯。类链状高分子生物聚酯材料集多种优良的性质于一身,如材料的性质多样性、生物可降解性、气体阻隔性、热塑性、生物相容性等,在日用化工、医药行业、生物降解材料、食品加工包装等诸多应用领域都十分具有广泛的开发应用的前景。然而,PHA的后续推广面临着发酵成本较高、成功商品化的PHA种类有限等问题,阻碍了此类生物高分子的进一步应用开发。本研究以从绿藻Ulva中分离出的一株具有PHA生产能力的微生物Massilia sp.UMI-21为研究目标,鉴定了该菌株碳源利用情况以及生产PHA的结构;完成了该菌株基因组测序,获得了其以淀粉作为碳源合成PHA的相关酶的代谢途径;利用基因敲除方法鉴定了其PHA代谢途径中淀粉分解酶对PHA合成的影响,并通过体外基因重组方法检讨了该菌PHA聚合酶PhaC的底物特异性。首先,Massilia sp.UMI-21可利用可溶性淀粉（冷水可溶）、木聚糖等作为碳源发酵时分别得到了最大1.214±0.078 g/L,0.538±0.040 g/L PHAs。但该菌株不能利用葡萄糖、果糖等单糖作为碳源积累PHAs。以淀粉作为碳源获得的产物的GC和1H-NMR检测结果表明,为聚3-羟基丁酸酯（P（3HB））。产物的凝胶渗透色谱（GPC）和差示扫描量热法（DSC）热性质分析研究结果显示P（3HB）分子量约为66.4 k Da,分散系数约为2.49,玻璃化转变温度为-7.3℃,结晶温度为31.9℃,熔融温度为172.0℃。其次,菌株Massilia sp.UMI-21基因组测序分析结果表明,UMI-21内部不含有质粒且只含有一条染色体,基因组大小为5.3Mb,GC含量为67.06%。基因功能注释结果表明,Massilia sp.UMI-21利用淀粉通过α-淀粉酶Amy A1和Amy A2水解为葡萄糖,通过糖代谢途径生成乙酰辅酶A（Acetyl Coenzyme A）,两个Acetyl Coenzyme A分子被β-酮硫解酶（Pha A）缩合成一个乙酰乙酰辅酶A（Acetoacetyl-Co A）分子,乙酰乙酰-Co A还原酶（Pha B）将Acetoacetyl-Co A还原成3-羟基丁酰-Co A（3HB-Co A）。最后3HB-Co A通过I型PHA合酶PhaC聚合成PHB,该PHA合成途径为典型的I类PHA合成途径。最后,利用自杀质粒敲除法,敲除了Massilia sp.UMI-21中的两个α-淀粉酶基因amy A1、amy A2构建三株基因敲除菌株Massilia sp.UMI-21Δamy A1、Δamy A2和Δamy A1&Δamy A2。PHA淀粉发酵结果表明三株敲除菌都不进行PHA的积累。实时荧光定量PCR表明,amy A1、amy A2基因敲除均导致其转录水平降低,且amy A2基因的敲除会使得amy A1转录水平降低。利用原核表达体系获得Massilia sp.UMI-21 PHA聚合酶PhaC（1.05mg/L）的底物特异性分析结果表明,该酶对3HB-Co A、2HB-Co A和D-lactate-Co A等底物具有聚合能力。本研究结果解明了Massilia sp.UMI-21利用淀粉合成PHA的代谢途径,为该菌株的PHA合成途径改造和扩大规模生产提供参考。
漆梦媛[3]（2021）在《活性污泥菌群完全矿化磺胺甲恶唑的特性与机制解析》文中认为我国是磺胺类抗生素（Sulfonamides,SAs）生产和使用大国。排放到环境中的SAs对生态环境造成了不良影响,其选择压力作用还会诱导抗生素抗性细菌的形成,对人类与环境健康造成潜在威胁。因此,寻求高效深度矿化SAs的方法具有重要的意义。目前已报道的SAs生物降解产物普遍矿化程度低、存在反转途径,无法彻底去除SAs。尽管近年来发现的由降解基因簇sad ABC调控的SAs好氧降解途径在矿化程度上有所提升,但仍存在氮杂环产物稳定积累问题,阻碍了SAs的彻底矿化。此外,大量已分离纯菌均不具备完全矿化SAs能力的事实,暗示着SAs的彻底矿化仅依靠单个菌株是不现实的,至少还有氮杂环产物降解菌亟待挖掘,甚至需要多物种相互作用实现SAs的完全矿化。活性污泥微生物由于长期暴露在SAs的选择压力下,能够驯化出具有SAs深度矿化能力的功能微生物菌群。通过以哈尔滨文昌污水处理厂的活性污泥为接种源,以磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole,SMX）作为唯一碳源和能源,获得了具有不同降解分工的富集液S1与S2,两者可分别于13.5 h和12 h内将50mg/L的SMX完全转化为等摩尔当量的氮杂环产物3-氨基-5-甲基异恶唑（3-amino-5-methylisoxazole,3A5MI）。当3A5MI的积累量达到最大值后,富集液S1与S2的降解效能发生显着差异,富集液S2始终稳定积累3A5MI,而富集液S1中3A5MI浓度逐渐降低直至消耗完全。这也导致了两者在总有机碳（TOC）去除方面的显着差异。在50 h,富集液S2最终TOC去除率为63.00±1.14%,而富集液S1的TOC去除率高达100%,实现了SMX的彻底矿化。另外,通过将碳源由SMX切换为3A5MI,从SMX矿化富集液S1中抽提到了3A5MI矿化富集液A。在具有不同SMX降解功能分工的富集液基础上,分离培养了两株核心降解菌Paenarthrobacter sp.P27与Nocardioides sp.N27,其功能地位具有重要性与唯一性:菌株P27是富集液中唯一能氧化断裂SMX分子结构中C-S-N键（SAs深度降解的起始关键步骤）,并以断键后的苯环侧产物作为唯一碳（氮）源与能源的细菌;而菌株N27是唯一能直接利用氮杂环产物3A5MI作为唯一碳（氮）源与能源的细菌。通过对比双菌（P27与N27）共培养与富集液S1在降解效能上的差异,暗示了间接降解菌（利用SMX降解过程中产生的小分子中间产物进行生长繁殖的细菌）对于实现SMX彻底矿化的必要性。富集液S1在50 h可达到100%的矿化率,而双菌共培养体系在90 h的矿化率仅为75.71±1.31%。由核心降解菌与间接降解菌组成的活性微生物菌群是实现SMX彻底矿化的关键功能单元,它们之间直接或间接的正相关相互作用也直接或间接地促成了SMX的彻底矿化。通过微生物群落结构演替分析,初步鉴定了7个SMX苯环一侧的间接降解菌属（Simplicispira、Sphingobium、Hydrogenophaga、Rhizobium、Achromobacter、Alicycliphilus以及Acidovorax）,与7个3A5MI间接降解菌属（Acidovorax、Simplicispira、Sphingobium、Alicycliphilus、Chryseobacterium、Pedobacter、Diaphorobacter）以及1个3A5MI间接降解菌科（Chitinophagaceae）。将不同菌属的相对丰度变化与对应时期的3A5MI降解动力学系数进行Pearson相关性分析发现,鞘脂菌属Sphingobium（r=0.5965,P=0.0005）和食酸菌属Acidovorax（r=0.8453,P<0.0001）与3A5MI降解速率的加快存在显着正相关性,Nocardioides、Sphingobium和Acidovorax三纯菌复配实验进一步验证了该相关性。另外,稳定性同位素核酸探针技术鉴定到了9个重要的OTUs,它们具有同化SMX苯环上C原子的能力。基于活性微生物的鉴定和分子生态网络分析,揭示了活性微生物间在长时间SAs选择压力下保留下来的正相关互作模式。
彭昭欣[4]（2021）在《不同柑橘种质中聚甲氧基黄酮评价、生物合成相关基因的挖掘与功能解析》文中进行了进一步梳理消费者主要从柑橘类果实中获取天然的聚甲氧基黄酮（Polymethoxylated flavones,PMFs）。作为具有特殊生物活性的功能性成分,PMFs对人体健康有益,且对柑橘生长逆境有防御作用。宽皮柑橘果实黄皮层中大量积累PMFs,但作为类黄酮代谢的支路,PMFs代谢和调控机制尚未明晰。因此,本研究首先通过反向遗传学手段:整合代谢组和转录组分析筛选PMFs生物合成相关O-甲基转移酶基因（OMTs）、利用体外异源表达和柑橘体内转基因等功能验证手段,再结合正向遗传学手段:通过人工杂交群体BSA-seq定位关键基因等方法鉴定了柑橘PMFs生物合成相关的3个主效基因并初步构建了红橘PMFs生物合成的代谢通路,最后通过分析主效基因在不同柑橘种质中的序列多态性和酶功能,初步阐明不同柑橘种质差异积累PMFs的分子机理。主要研究结果如下:1.柑橘自然种质和几个柑橘人工杂交群体中PMFs谱的分析本研究运用UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS与HPLC分析相结合,对116种柑橘不同组织中的11种主要PMFs进行了综合评价,揭示了PMFs积累的时空特异性和种质特异性。在所调查的自然群体中,PMFs在所有宽皮柑橘种内和种间杂交种质中均能被检测到,尤在果实发育早期的野生或早期栽培宽皮柑橘果实黄皮层中富集,但在柚、枸橼、金柑、枳、宜昌橙、蚝壳刺和莽山野柑等种质中未检测到,表明PMFs的生物合成可能起源于原始宽皮柑橘,PMFs积累表型在自然群体中可能属于显性性状,且与宽皮柑橘相比,其种内和种间杂交种质中PMFs总含量降低。基于多柑橘种质的PMFs代谢谱评价,可对富含总PMFs或特定PMFs的功能性柑橘育种提供理论依据。对6个柑橘杂交子代群体果实黄皮层或叶片中的PMFs进行了分析,发现在红橘（大量积累PMFs）×枳（不积累PMFs）和沙田柚（不积累PMFs）×砂糖橘（大量积累PMFs）F1代杂交群体中积累PMFs的表型发生分离。亲本中积累的PMFs物质种类在部分F1子代中总是同时出现但含量降低,或者不积累,具有PMFs积累表型的子代比例接近1/8或1/9,据此推测F1代中积累PMFs的表型可能属于一种质量性状,且为隐性性状。此外,处红柚和翡翠柚的正交和反交群体中均未检测到PMFs,再次验证柚中PMFs生物合成通路的缺失。2.PMFs生物合成相关基因的筛选和功能验证基于枳、华农红柚和红橘不同组织中差异积累PMFs的代谢特征,本研究结合代谢组和转录组数据筛选红橘黄皮层中高表达的OMTs,同时利用基因共表达分析、相关性分析等方法筛选到18个与PMFs合成相关的候选OMTs。通过酿酒酵母和大肠杆菌异源表达系统表达候选OMTs,经3种底物饲喂,初步确定了5个重组OMT酶对黄酮具有O-甲基化催化活性;进一步添加更多类型的黄酮底物,经LC-MS鉴定产物,初步构建了由芹菜素从头合成红橘中7种PMFs的代谢通路。并经柑橘愈伤组织稳定超表达、烟草和柑橘叶片瞬时注射等实验验证了OMT3、OMT5和OMT7基因在植物体内的生物学功能。其中OMT3和OMT7表现出7-,4′-位保守的O-甲基化催化活性,OMT4和OMT5鉴定为6个位点的多功能O-甲基转移酶,这是首次在植物中验证类黄酮5-O-甲基化功能,初步构建红橘特异的PMFs代谢通路,为提高柑橘果实品质、功能性柑橘育种及工厂化生产PMFs提供理论支撑。3.利用BSA分析定位PMFs生物合成主效基因本研究利用红橘×枳杂交群体F1代中具备PMFs积累和不积累表型的单株进行BSA-DNA测序,进一步利用SNPs分子标记定位到克里曼丁基因组Scaffold4上一段长度为7.58Mb的候选区间,巧合的是该区间包含7个串联排列的OMTs,且OMT3、OMT4、OMT5和OMT6基因序列高度相似,其余3个OMTs在红橘转录组中几乎无表达。其中OMT4和OMT5在3个宽皮柑橘种质的黄皮层中具有极高表达量,且其重组酶对黄酮6个位点具有O-甲基化催化功能,重组OMT3酶仅具有7-和4′-位O-甲基化催化功能,而重组OMT6酶对黄酮无O-甲基化功能,表明OMT3、OMT4和OMT5可能是柑橘中PMFs生物合成的主效基因。4.不同柑橘差异积累PMFs的分子机理和相关转录因子的筛选扩增22种代表性柑橘种质中3个主效OMTs的序列,并利用系统进化树分析110份柑橘重测序数据中3个主效OMTs的序列,均发现不同柑橘种质中3个主效OMTs的序列多态性,大部分不积累PMFs的种质中3个主效OMTs的同源基因出现提前终止,而在积累PMFs的种质中均发现与3个主效基因序列与红橘一致或高度相似。然而,四季橘、红河大翼橙和佛手中3个主效基因序列正常但不积累PMFs,推测可能因为缺少黄酮底物。因此,OMT3、OMT4和OMT5序列多态性导致的酶功能差异是不同种质中PMFs积累差异的重要原因之一,且3个基因序列的系统进化树分析分析可将不同柑橘种类清晰分类。此外还筛选到18个与PMFs生物合成呈正相关的转录因子和1个负相关的转录因子。
胡博淳[5]（2021）在《番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究》文中进行了进一步梳理环氧化物水解酶（Epoxide hydrolases,EHs）能够催化环氧化物进行动力学拆分或归一性水解反应,制备光学纯的环氧化物或其相应邻二醇。手性环氧化物和邻二醇作为高附加值的中间体,可以用来合成多种具有复杂生物活性的化合物,在医药领域发挥重要作用,带来了可观的经济效益。相应地,这些高价值中间体的应用加速了EHs催化领域的研究进程。然而,目前EHs的研究存在一些如底物广谱性差、立体选择性不理想等问题。为了改善这些问题,在催化制备手性环氧化物及邻二醇时提供更多的理想选择,本课题首先在生物信息学分析的基础上,从番茄中克隆并异源表达了两种EHs;其次分别测定了它们的基本酶学性质和底物谱特征;最后根据其各自在底物谱测定时所发现的问题,进行了深入的研究,研究结果如下:（1）在生物信息学分析的基础上,从番茄中克隆了两种EHs基因——sleh1和sleh2。它们编码了全长为321个氨基酸的蛋白质,分别为Sl EH1和Sl EH2,两者都属于α/β水解酶家族,是两种新型植物来源的EHs。对两种酶进行异源表达,构建了重组大肠杆菌——E.coli/sleh1和/sleh2,确定了其最适诱导温度、时长及IPTG的添加量,分别为25℃、8 h和0.05 m M。对两种酶进行纯化分析,发现Sl EH1的最适反应p H在7.0～7.5之间,在p H 6.5～8.5的范围或温度40℃以下时催化表现稳定。（2）从Sl EH1和Sl EH2对不同底物的催化活性、对映选择性和区域选择性等方面,分析了两种酶在合成手性环氧化物及其邻二醇方面的应用潜力。Sl EH1对rac-对氯环氧苯乙烷（2a）的对映选择性（E值>200）是迄今为止所发现的EHs中最高的,并且对rac-1,2-环氧辛烷（11a）表现出了归一性水解的潜力,其催化生成的产物（R）-1,2-辛二醇（11b）的eep值为51.3%。Sl EH2则对rac-环氧苯乙烷（1a）表现出了归一性水解的特性——其催化20 m M的rac-1a水解,最终得到（R）-1,2-苯乙二醇（1b）的eep值为87.1%,产率高达94.4%。（3）对Sl EH1进行分子改造,提高其催化rac-11a的αS值,从而提高其产物的eep值。在Sl EH1与（S）-11a对接模拟基础上,选择了Sl EH1的底物结合口袋中10个拟突变位点。构建并筛选一系列的突变酶,最终选出了最优的——Sl EH1W106T/F189L,其αS值从55.3%大幅度提高至96.7%,催化归一性合成（R）-11b的eep值从51.3%提高至95.4%。使用E.coli/sleh1W106T/F189L在24 h内可催化400 m M（51.3 g/L）rac-11a有效水解,生成（R）-11b的eep为94.7%、产率为95.6%。对Sl EH1W106T/F189L进行底物谱分析,其合成（R）-1,2-葵二醇（12b）的eep从9.5%提高到了83.0%;合成（R）-1,2-二醇-7-辛烯（14b）的eep高达97.4%。（4）为了提高E.coli/sleh2全细胞归一性水解rac-1a的最大底物加载量,对其反应媒介进行了优化。通过构建并筛选一系列的反应媒介,最终发现,E.coli/sleh2在30%（vs/vb）吐温-20/磷酸缓冲液反应媒介中,可将rac-1a有效水解的加载量从200 m M提高至400 m M。在该反应体系中对（R）-1b进行克级规模制备,最终可得到（R）-1b（eep=96.2%）的产率为97.2%。并且30%（vs/vb）吐温-20/磷酸缓冲液媒介具有良好的广谱性,可以分别使E.coli/pveh1Z6催化350 m M的rac-间氯环氧苯乙烷的转化率从44.9%提高到>99%;E.coli/rpehL360C催化500 m M的rac-间硝基环氧苯乙烷的转化率从67.7%提高到>99%。
张舒[6]（2021）在《Aspergillus niger An76木聚糖同工酶降解模式的研究》文中进行了进一步梳理木聚糖是最丰富的半纤维素多糖,包裹在纤维素外层,与纤维素和木质素一起构成了“生物质抗降解屏障”。木聚糖的有效降解不仅可以加速木质纤维素资源的生物转化,而且其降解产物及衍生物如木寡糖、木糖醇等都是高附加值产品,因此木聚糖的高效高值降解是利用木质纤维素资源的重要一步。曲霉属丝状真菌的基因组含有大量编码木聚糖同工酶的基因,编码多种木聚糖同工酶,因此曲霉属真菌展示出了强大的木聚糖降解潜力。多组分的木聚糖酶在木质纤维素的降解中是如何发挥作用与功能的目前还不清楚。因此,系统全面地研究木聚糖同工酶的降解模式,了解微生物分泌多个同工酶降解半纤维素的过程,探讨不同木聚糖同工酶的转录调控、作用模式和协同作用的机制,以进一步揭示微生物降解半纤维素的机理,对酶系协同实现高效催化有重要科学意义,也对于指导生产具有实际应用价值。黑曲霉（Aspergillus niger）An76拥有最完整的木聚糖降解酶系基因,包括4个GH11 β-1,4-内切木聚糖酶基因和5个不同家族的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因。本研究以A.niger An76为研究对象,结合定量转录、分子生物学、生物化学和结构生物信息学的手段,对其GH11内切木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了深入系统的研究,取得如下主要研究成果:1.对黑曲霉同一 GH11家族不同β-1,4-内切木聚糖酶组分进行了生理生化生信分析,揭示了不同组分之间对木聚糖降解能力的细微差异。Aspergillusniger An76编码4种GH11 β-1,4-内切木聚糖酶,定量转录结果表明,其中XynA和XynB在木糖类底物中被上调,但分泌次序和分泌量各不相同,XynA首先被诱导,其次是XynB被诱导,而XynD和XynE始终未见诱导表达。异源表达了 GH11家族的四个木聚糖酶组分（XynA、XynB、XynD和XynE）并进行了生化性质表征,结果显示它们都是中温偏酸性酶,最适温度为50℃,最适pH为5.0,其中XynB的比酶活是XynA的8倍。产物谱分析表明XynA偏好降解木六糖,XynB和XynD偏好降解木四糖。对GH11木聚糖酶活性中心进行结构生物信息学分析,结果表明GH11木聚糖酶的不同降解偏好与活性中心的功能残基和底物之间形成的复杂氢键有关。且在降解山毛榉木聚糖时XynA和XynB具有明显的协同作用。结合生理和生化实验,证明A.nigerAn76的多个GH11 β-1,4-内切木聚糖酶在降解木聚糖时是有分工的,首先分泌XynA降解大寡糖,然后分泌具有高酶活性的XynB降解小寡糖。该研究结果说明,木聚糖酶多组分之间的这种协同作用是微生物用来促进木聚糖有效降解的一种策略。2.对黑曲霉不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了生理生化分析,证明不同家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有不同底物特异性和降解模式。在A.niger An76的基因组中,存在5个编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因,其编码的阿拉伯呋喃糖苷酶（AxhA、AbfA、AbfB、AbfC、AbfD）分属于GH62（AxhA）、GH51（AbfA、AbfC）、GH54（AbfB）和 GH43（AbfD）家族。定量转录结果表明,GH62家族的AxhA和GH54家族的AbfB两个酶组分在各种木糖类底物中均被明显诱导;GH51家族的AbfC在带侧链的木聚糖底物诱导的后期转录量上升。异源表达了 AxhA、AbfB、AbfC三个阿拉伯呋喃糖苷酶,其最适温度均为50℃,最适pH也相同,均为pH 5.0。底物特异性测定的结果显示,AxhA对主链为木聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高,而AbfB对主链为阿拉伯聚糖、侧链为阿拉伯糖基的底物活性最高,AbfC对pNP-AraF有明显的特异降解能力。通过对三者降解聚糖的产物谱进行分析,确定了 AxhA和AbfB均能断裂α-1,2/α-1,3-糖苷键,释放阿拉伯糖,但AxhA断裂α-1,2/α-1,3连接的糖苷键的效率更高,而AbfB除作用于α-1,2/α-1,3的连键外,还具有水解α-1,5-糖苷键的活性。由此可知,A.niger An76通过编码底物特异性及降解偏好不同的阿拉伯呋喃糖苷酶,从而实现半纤维素的有效降解。未来可基于不同的底物结构精确定制降解酶,实现生物质的高效与高值降解与转化。3.初步完成了Aspergillus niger An76遗传操作系统构建的实验设计,明确了部分实验条件,为该菌后续进行遗传操作奠定了基础。以构建Aspergillus niger An76遗传操作系统为目的,确定了其进行遗传操作的基本条件。首先,确定了制备原生质体的最佳酶组合:1%哈茨木霉来源的裂解酶和0.5%蜗牛酶;确定 A.niger An76的抗性选择性标记:草铵膦抗性基因bar,有效抑制浓度为2.0%;确定了 5’-FOA在A.niger An76转化中的使用浓度:2 mg/mL。采用同源重组的方法设计了pyrG基因的敲除实验,获得部分重组转化子。通过初步构建的尝试,为实现Aspergillusniger An76进行遗传操作奠定了技术基础。
陈琳[7]（2021）在《海洋褐藻胶裂解酶资源挖掘及特性研究》文中进行了进一步梳理褐藻胶是一种可再生碳水化合物资源,其降解产物褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗氧化和降血压等多种生物学活性。但是褐藻胶因其粘度大、难以被吸收利用等性质限制了其工业化生产和应用范围。生物酶法是降解褐藻胶的重要方法,目前,降解褐藻胶主要有两个方向:一是筛选高效褐藻胶降解菌,其在适宜条件下生长并产生褐藻胶裂解酶直接降解褐藻胶;二是构建基因工程菌株,以此提高褐藻胶降解效率。本研究从这两个方面来挖掘褐藻胶裂解酶资源,具体研究内容及结果如下:1.褐藻胶降解菌的筛选鉴定及产酶条件优化。通过微生物可培养的方法从红树林沉积物样品中分离得到一株高效褐藻胶降解菌FG2-1,根据细菌16Sr RNA相似性初步判定该菌为微泡菌属成员,将其命名为Microbulbifer sp.FG2-1。以碳源、氮源、氯化钠、培养基初始p H、培养温度和摇床转速为实验单因素,确定了菌种发酵培养基最优成分（g/L）为:海藻酸钠4,硝酸铵1,氯化钠10,七水硫酸镁1,磷酸氢二钾2。最佳发酵条件为:培养基初始p H6.5,培养温度为33℃,摇床转速为150 rpm。在最佳条件下培养24 h后酶活可达到11.5 U/m L,比优化前提高了1.9倍。2.菌株FG2-1的基因组及生物信息学分析。对菌株FG2-1进行了基因组测序,测序结果显示,FG2-1的基因组大小为4,618,149 bp,GC含量为47.0%,有4248个蛋白编码序列,利用RAST和CAZy数据库注释得到7个褐藻胶裂解酶基因,KEGG数据库注释表明该菌株有完整的褐藻胶代谢途径。对预测到的7个褐藻胶裂解酶基因进行生物信息学分析,MAL1～MAL3和MAL5属于PL7家族,MAL4属于PL6家族,MAL6和MAL7属于PL17家族。它们均为亲水性蛋白,不具有跨膜区。其中MAL6和MAL7预测其为PL17家族的外切酶,MAL1～MAL3和MAL5具有PL7家族保守的催化氨基酸和PL7家族典型的三维结构,MAL4具有PL6家族褐藻胶裂解酶典型的三维结构,但其催化位点的关键氨基酸保守性较差,推断其具有降解褐藻胶及其它多糖的潜在能力。3.羊鲍肠道弧菌YBCH1＿8褐藻胶裂解酶基因val1的异源表达及酶学性质探究。以羊鲍肠道弧菌YBCH1＿8的基因组为模板,通过PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因val1,成功构建了重组表达菌株E.coli BL21（DE3）/p ET22b（+）-val1,18℃下经1 mmol/L IPTG诱导24 h,获得重组蛋白,经蛋白纯化后,比酶活达到6.6 U/mg。从温度、p H、金属离子及表面活性剂、动力学分析、底物特异性及降解产物方面研究酶学性质,结果表明,重组酶r VAL1的最适温度为30℃,在10～30℃下保温30 min,剩余酶活能保持80%以上;最适p H为8.5,在p H4.5～10.0保温30 min,剩余酶活保持50%以上;1 mmol/L Mn2+、Ca2+和Co2+对其具有明显促进作用,Fe2+完全抑制重组酶活性,Fe3+和SDS对酶活也有明显抑制作用;动力学参数Vmax为21.70 mg/（m L·min）,Kcat为3.28s-1,米氏常数Km为2.23 mg/m L;重组酶对海藻酸钠的底物特异性大于Poly G和Poly M;TLC分析重组酶降解产物为单糖。结果显示,该重组酶是一种具有适冷特性的外切型褐藻胶裂解酶,在生物燃料的生产制备方面具有应用潜力。海洋作为一个巨大的酶资源库,还有更多潜在价值的褐藻胶裂解酶资源等待挖掘,本研究为挖掘海洋褐藻胶降解菌和褐藻胶裂解酶基因资源奠定了基础,为褐藻寡糖的制备及利用褐藻生产生物乙醇提供了很好的酶资源。
郑莎[8]（2021）在《桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究》文中认为自从1958年耶鲁大学的科学家Lerner从牛的松果体中首次分离出褪黑素以及1995年Dubbels和Hattori等学者率先从高等植物番茄、牵牛花等植物中鉴定到褪黑素以来,褪黑素在动植物中的功能受到了科学家们的广泛关注和研究。大量研究表明:褪黑素能够参与到植物生长发育的各个阶段,参与调控植物的各种生理活动;在动物体内,褪黑素起着重要的时间生物学作用,调节昼夜节律,维持节律稳定,具有改善睡眠、治疗神经衰弱和提高免疫等功效。因此,褪黑素在日常生活中作为睡眠调节药物被广泛使用,常用于调整由飞行时差或其他睡眠失调导致的生物钟紊乱,从而改善人的睡眠觉醒周期和昼夜节律。随着我国经济的全球化和快速发展,人们由于频繁时差切换和高强度轮班工作等无规律生活节奏而导致其体内褪黑素分泌合成失调并引起昼夜节律失调的现象也越来越多。许多研究表明通过经常进食高褪黑素含量的动植物食药材能有效补充人体内褪黑素含量并维持其代谢稳态而改善昼夜节律失调。因此,寻找和研究褪黑素高含量的动植物食药原料,特别是高褪黑素含量的大众植物食药原料具有重要现实价值。桑树（Morus alba L.）原产于中国,一直作为家蚕饲料而被大量种植,自古以来便是中国主要经济作物之一。以往对桑树的研究,主要集中在桑树品种选育、桑树栽培和病虫害防治等方面,其目的是为家蚕提供高产、优质的桑叶饲料。随着对桑树的深入研究,发现桑树不同部位富含多种营养成分和活性物质,使得其营养价值和药用价值也受到人们的关注,因而被国家卫生部列为“药食同源”的植物资源。最近研究表明与其他许多中药材和水果相比,桑叶和桑葚都属于高褪黑素含量植物资源,被认为是补充褪黑素最佳原材料之一。有研究表明同一植物物种内不同栽培品系或种质间褪黑素含量差异巨大,我国是桑树种质资源最丰富的国家,不同桑树种质资源圃收集并保存着大量的种质资源。因此,从大量桑种质资源中筛选出高褪黑素含量的桑品种或种质不但可作为人们日常生活中褪黑素补充合适的植物原料,也能为研究桑树高效褪黑素分子合成机理提供研究材料,具有重要的现实和科学意义。目前为止,为数不多的桑树褪黑素研究报道主要集中在其鉴定和含量测定方面,而桑树种质资源褪黑素及其异构体种类的系统鉴定、含量测定、高含量种质筛选及其生物合成分子机制尚未见报道,极大阻碍了桑树作为高效补充人体褪黑素大众原料的应用及其深度开发和多元利用。综上所述,本研究首先利用UPLC-MS/MS检测技术鉴定不同桑树品种/种质的褪黑素,并对50个不同桑树品种/种质褪黑素含量做定量分析筛选出褪黑素含量最高的桑树品种/种质。其次,利用生物信息学方法,从褪黑素含量最高桑种质—川桑（M.notabilis）全基因组数据库中鉴定出参与褪黑素生物合成相关基因,并开展表达谱分析,筛选参与褪黑素高效合成关键基因并开展体外酶活实验,阐明川桑高效合成褪黑素的分子机制。在桑树褪黑素鉴定实验中意外鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体并对不同品种桑树褪黑素异构体进行了定量分析。为了获得桑叶最佳收获部位和季节,对影响桑树中褪黑素和异构体总含量的非遗传因素也做了初步探究。由于本研究首次在植物组织中鉴定到天然褪黑素异构体,加上有关褪黑素异构体生物合成途径从未见报道过,故选取四个桑树品种不同组织为材料,用UPLC-MS/MS鉴定其不同组织中的褪黑素和异构体。同时利用qRT-PCR分析褪黑素生物合成相关候选基因的表达量,并筛选出可能参与褪黑素异构体生物合成的靶标基因,开展其体外酶活功能的验证分析,拟阐明桑树褪黑素异构体生物合成分子途径,为进一步解析其生物合成分子机理奠定了良好的基础。所获得的结果如下:1.不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选利用UPLC-MS/MS在鉴定不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量过程中,鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体。在50个不同的桑树品种中,1个桑树品种/种质仅含有褪黑素,42个桑树品种仅含有褪黑素异构体MI-1,而其余7个既含有褪黑素又含有MI-1。为了探究不同桑树品种/种质之间褪黑素含量的差异,分析了50个不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量。结果表明桑树中褪黑素含量为0.26至0.83 ng/g,相差3倍,最高五个桑种质依次是川桑、西农6071、神农架长穗桑、嘉陵16号和嘉陵20号。褪黑素及其异构体的总含量为0.23至20.58ng/g,相差89倍,最高五个桑种质依次是策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、印度桑和甘洛6号。根据测定结果表明川桑、西农6071、神农架长穗桑可作为最佳补充褪黑素的原材料。为了探究环境条件对桑树褪黑素及异构体的影响,利用UPLC-MS/MS检测了不同采摘时间和不同成熟度的桑叶中褪黑素及异构体含量。结果表明褪黑素及其异构体总含量随着采摘时间的先增加后降低,随着叶片成熟度的增加逐渐增加。以上研究结果表明,在6月28日,第20叶位采摘策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、叶片可获得最高褪黑素和异构体含量的桑叶原料。2.川桑（Morus notabilis）褪黑素高效生物合成分子机制解析褪黑素含量最高桑种质为川桑,在川桑基因组数据库中鉴定到37个褪黑素生物合成相关候选基因。以“川桑”为模板成功克隆到37个褪黑素生物合成相关的候选基因,即:一个色氨酸脱羧酶基因（MnTDC）,7个色胺5-羟化酶基因（MnT5H1-7）,6个5-羟色胺N-乙酰基转移酶基因（MnSNAT1-6）基因,20个N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶基因（MnASMT1-20）和3个咖啡酸-氧-甲基转移酶基因COMT（MnCOMT1-3）。生物信息学分析表明桑树中褪黑素合成相关候选基因的结构特征与已经报道的褪黑素生物合成相关基因基本一致。结构域预测和多序列比对分析表明这些蛋白质都具有各蛋白家族催化活性所需的结构域和活性位点。利用qRT-PCR技术研究了褪黑素生物合成相关基因在川桑根、茎、叶和皮中的表达情况,结果表明这些基因在各组织中的表达模式不一,同一家族的不同基因表达量差异较大。MnTDC基因在川桑叶中的表达量是最高的。T5H1和T5H2相比较其他5个T5H基因在根、茎、叶和皮中的表达量较高,T5H7在四个组织多种的表达较低。SNAT1-SNAT5这5个基因的表达模式一致,但SNAT5基因在茎中的表达量是SNAT1的在茎中表达量的20倍。而SNAT6在4个组织中几乎不表达。20个ASMT基因中,ASMT12基因的在根和皮中的表达量是最高的,ASMT3基因在4个组织均不表达,除此之外其他的18个ASMT基因在4个组织中的表达量差异较大。MnCOMT1在茎中的表达最高。构建原核表达载体pCold TF-MnTDC、pCold TF-MnT5H2、pCold TF-MnSNAT5、pCold TF-MnASMT12和pCold TF-MnCOMT1,转入大肠杆菌,分别表达这5个重组蛋白并获得相应可溶的重组蛋白。体外酶活表明MnTDC重组蛋白与底物色氨酸在缓冲液中共孵育鉴定到产物色胺。MnT5H2重组蛋白与底物色胺在缓冲液中共孵育鉴定到产物5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与底物5-羟色胺、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到产物N-乙酰5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与5-甲氧基色氨、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到褪黑素。MnASMT12重组蛋白分别与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnASMT12重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。MnCOMT1重组蛋白与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnCOMT1重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。前人关于ASMT蛋白家族的研究表明,ASMT蛋白家族被分为三个亚家族（I,II,III）,但仅有一个亚家族的成员编码的蛋白表现ASMT蛋白酶的活性。在川桑中MnASMT12属于MnASMT蛋白家族的第I亚族,催化N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素,5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。为了探究MnASMT蛋白家族第II亚家族和第III亚家族成员的功能,我们根据MnASMT各亚家族基因的表达量,选择MnASMT第II亚家族的MnASMT16和第III亚家族的MnASMT20进行进一步研究。将重组的载体pCold TF-MnASMT16和pCold TF-MnASMT20在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,分别获得MnASMT16和MnASMT20重组蛋白。将N-乙酰5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液混合和孵育,用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明MnASMT16和MnASMT20都具有将N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素的能力。此外,将5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液进行共孵育,并使用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明只有MnASMT20重组蛋白将5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。总而言之,酶动力学和体外偶联测定结果表明桑树的褪黑素生物合成不但有多条不同途径,而且所有条途径都能有效地催化色氨酸转化为终产物褪黑素。此外,ASMT基因家族中三个亚家族基因编码的蛋白都有ASMT蛋白酶活性。以上结果表明,川桑可通过多途径、多基因能高效地催化色氨酸向褪黑素转化,可能是其保持丰富褪黑素含量的关键分子机制。3.桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析我们使用相同的桑树品种的不同的组织为实验材料,并利用相同提取和检测方法开展了褪黑素及其异构体的鉴定和定量分析。研究结果表明4个桑树品种褪黑素异构体的种类也有差异。4个桑树品种叶片中都含有褪黑素和两种褪黑素异构体（MI-2和MI-3）,果中仅含有褪黑素和异构体（MI-2）,其中“大十”叶和果中褪黑素及其异构体总含量都是最高的。利用qRT-PCR分析了褪黑素合成相关基因在两个桑树品种“大十”和“白玉皇”的叶、果中的表达情况。结果表明,除MaASMT4和MaASMT20都具有桑叶特异性高表达的模式外,其他参与褪黑素生物合成的基因在两个品种和两个器官的表达模式均不一致。为了进一步确认MaASMT4和MaASMT20两个基因桑叶特异高表达的模式,利用qRT-PCR分析结果表明MaASMT4和MaASMT20在“嘉陵30陵和“中桑5801MT都具有桑叶特异性高表达的模式,这种表达模式与MI-3特异存在叶中的模式一致。因此,将MaASMT4和MaASMT20两个基因作为合成褪黑素异构体MI-3的关键基因进行进一步的分析。以“大十”为模板克隆了MaASMT4和MaASMT20基因并构建原核表达载体pCold TFMaASMT4和pCold TF-MaASMT20,转入大肠杆菌表达其蛋白。外源表达的MaASMT4和MaASMT20重组蛋白体外酶活分析结果表明:属于ASMT基因家族第III亚家族的MaASMT4和MaASMT20在体外都能催化底物N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素异构体MI-3。为了探究MaASMT蛋白家族第I和第II亚家族成员的功能,基于其他两个亚家族不同基因的表达量,以“大十”员为模板克隆了ASMT基因家族第I和第II亚家族的MaASMT9和MaASMT16基因。构建原核表达载体的pCold TF-MaASMT9和pCold TF-MaASMT16转入大肠杆菌表达其重组蛋白。体外酶活结果表明ASMT蛋白家族第I亚家族的MaASMT9和第II亚家族的MaASMT16两个重组蛋白都能催化N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素。这些结果表明褪黑素异构体生物合成分子途径与褪黑素相似,白桑能用特定亚群的ASTM成员实现其体内褪黑素异构体的合成,为进一步植物褪黑素异构体生物合成分子机理解析打下了良好的基础。
吴昊[9]（2021）在《酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖及催化机理的研究》文中研究指明N-乙酰氨基葡萄糖是一种在制药、医学、食品、化妆品等领域具有广泛应用的多功能单糖,尤其在治疗骨关节炎、骨质疏松方面具有显着的功效。目前,市场上以几丁质为原料制备Glc NAc的方法仍然停留在传统的化学酸解法,该方法缺点明显:污染环境,生产安全隐患大,效率低。而酶解法是一种绿色、环保的以几丁质为原料制备N-乙酰氨基葡萄糖的新方法。本实验室前期已构建好一株重组几丁质酶,可以有效降解胶体几丁质。在此基础上,进行了以下几项工作:（1）进一步研究了实验室已有的几丁质酶（Chi A）的酶学性质及其催化特性:Chi A的最适反应温度为50℃,在50℃以下酶热稳定性良好;最适反应p H为6.0,酶也较为稳定;通过质谱及HPLC结果确定Chi A水解胶体几丁质的产物为（Glc NAc）2。（2）构建了一株重组β-N-乙酰基己糖胺酶工程菌E.Coli BL21（DE3）/p ET-28a（+）-HJ5N,优化了β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N的产酶条件并研究了其酶学性质。结果表明:在诱导温度为25°C,IPTG诱导浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为11 h条件下,HJ5N酶活最高可达440 U/m L;SDS-PAGE显示HJ5N分子量在55k D左右,最适温度为50℃,在40℃以下有较好的稳定性;最适p H在6.0左右,在p H 5.5-6.5范围内具有较好的稳定性。不同金属离子化合物对HJ5N酶活的影响不显着,无明显的促进或者抑制作用;以p NP-Glc NAc为底物测定了HJ5N的动力学常数Km及Vmax:Km值为0.64mmol/L,Vmax值为3.42mol/（min.L）,动力学参数表明HJ5N对p NP-Glc NAc具有较高的亲和力和反应速率,与Chi A相似的酶学性质表明Chi A和HJ5N可以协同催化降解胶体几丁质。（3）以上述双酶的酶学性质研究为基础,成功建立了几丁质酶（Chi A）和β-N-乙酰基己糖胺酶（HJ5N）协同催化降解胶体几丁质制备Glc NAC的新方法,研究了双酶的协同机制。结果表明Chi A存在产物抑制现象,而HJ5N的加入可保证中间产物快速被转化为单糖从而消除这种抑制作用,双酶协同催化效率提高了一倍;最后通过分离纯化获得了纯度极高的Glc NAc,并对其进行了结构表征。（4）采用单因素及正交设计实验对双酶协同催化体系的反应条件进行了优化。结果表明,反应最适反应温度为30℃,最适p H为6.0,最优底物浓度为9%,Chi A:HJ5N添加比例为2:1,总添加量为52.5 U/m,在上述最优反应条件下反应12 h可达到最大Glc NAc浓度18 mg/m L,转化率为60%,研究结果为酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖的工业应用提供了一种有效策略。
孙小雯[10]（2020）在《基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化》文中研究表明维生素K2是一类侧链长度不同的异戊烯基化甲萘醌产品的总称,属于衍生脂质。其中四烯甲萘醌（MK-4）在促进凝血和防治骨质疏松症方面具有良好的效果,在临床上具有较高的应用价值。大肠杆菌和毕赤酵母作为两种成熟高效的蛋白表达系统,已被成功地应用于多种异源蛋白的表达。本课题组已经在大肠杆菌中成功实现了 MK-1从无到有的生物合成,而侧链长度更长的MK-4的生物制造将是我们下一步要实现的目标。毕赤酵母表达系统具有繁殖迅速、易于高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后加工修饰,易获得可溶性活性重组蛋白等优点,尽管在毕赤酵母中尚未发现甲萘醌的生物合成途径,但这也可以在一定程度上避免复杂的分支途径和反馈调节机制对重构路径造成的不利影响。因此,为实现MK-4的高效生物制备,本研究运用合成生物学理念,基于多维度的信息整合,将高效的酶和生物合成途径整合到大肠杆菌和毕赤酵母底盘细胞中,构建以廉价的VK1或VK3为原料的MK-4高效生物制备的细胞工厂,并通过分析其优缺点以确定最佳的表达系统。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盘细胞种类,为VK2等异戊烯基化产品的生物合成途径构建与优化提供了新的思路,具有重要的理论和应用价值。论文首先从物质和能量代谢角度出发在E.coli中重构MK-4代谢途径,通过MBP促溶标签实现古细菌来源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基础上通过敲除pgi基因,调控EMP、PPP和EDP三条葡萄糖分解代谢途径的分配,强化胞内还原力NADPH的合成,使重组菌株胞内的MK-4含量达到0.78 mg/L。由于其合成能力未达预期,同时考虑到菌株稳定性和生物安全性等问题,将在毕赤酵母中开展后续的研究工作。通过对KEGG等数据库信息的整合,利用生物合成途径设计软件BioSynther,以VK3和IPP作为底物对MK-4的生物合成途径进行理性设计,并确定催化萘醌骨架与异戊烯基侧链聚合反应的关键酶HsUBIAD1。为了制定更好的蛋白表达策略,对该蛋白的理化性质、结构以及催化活性中心等进行了相关的生物信息学分析。利用生物信息学分析的结果,构建产HsUBIAD1蛋白的重组毕赤酵母,并结合多重筛选机制,获得高产重组毕赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的摇瓶水平上,对筛选出的高产菌株GGU-23的基本发酵过程参数进行优化,并确定了24℃,初始pH 7.0,培养36h的摇瓶发酵工艺,优化后的GGU-23菌株的生物量达到31.0 g/L,较优化前提高了 6.9%,蛋白表达量提高了 4.8倍。为了表征HsUBIAD1的酶学性质,利用Ni-NTA亲和层析柱和重力型去盐柱从重组GGU-23菌株中获得纯化的HsUBIAD1蛋白,并进行初步的动力学分析,确定了体外的最佳酶促反应体系和条件:初始pH 7.0,31℃,当Mg2+参与的条件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3异戊烯基化反应的活性最高,较优化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通过与蛋白的活性中心的关键氨基酸发生相互作用,改变其内部构象,使异戊烯基侧链与活性中心氨基酸残基的结合能力增强,进而促进酶促反应的进行。在GGU-23菌株全细胞催化的研究中,发现其具有催化外源VK1和VK3异戊烯基化反应合成MK-4的能力,当以VK3作为全细胞催化体系的底物时,胞内MK-4的含量达到2.03 mg/L,实现了初代重组毕赤酵母菌株从无到有合成MK-4的突破。为了获得新一代的细胞工厂,需要对初代细胞工厂的细胞性能进行优化,提高其MK-4的合成能力。通过构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体,将外源侧链合成途径的关键酶SaGGPPS整合到产MK-4的初代毕赤酵母细胞中,强化侧链合成前体GGPP的供给,使全细胞催化体系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通过融合表达策略,将SaGGPPS与其上游的PpIDI蛋白进行融合表达,侧链合成途径得到了进一步的优化,MK-4的含量达到5.86 mg/L,较之前又提高了78.1%。实现了毕赤酵母菌株（GGU-GrIG）目标产物合成性能从低到高的优化。为了进一步挖掘优化后的毕赤酵母细胞工厂的应用潜力,继续对工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全细胞催化工艺进行优化,摸索出最合适的工艺参数,即在30℃,250 rpm的条件下,从催化反应开始起每间隔6 h,向催化体系中添加40 mg/L VK3溶液,连续培养18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌经过优化,MK-4产量达到7.55 mg/L,较优化前提高了 28.8%,表现出良好的稳定性和应用潜力。
二、hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征（论文提纲范文）
（1）自给自足型P450单加氧酶的发现、表征、改造及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞色素P450单加氧酶研究概况 |
| 1.1.1 P450单加氧酶简介 |
| 1.1.2 P450单加氧酶的结构 |
| 1.1.3 P450单加氧酶的催化机制 |
| 1.1.4 P450单加氧酶的分类 |
| 1.1.5 P450单加氧酶催化的反应类型 |
| 1.1.6 P450单加氧酶的应用 |
| 1.2 P450单加氧酶的分子改造 |
| 1.2.1 蛋白质改造策略 |
| 1.2.2 定向进化 |
| 1.2.3 理性设计 |
| 1.2.4 半理性设计 |
| 1.3 自给自足型P450单加氧酶 |
| 1.3.1 自给自足型P450单加氧酶研究进展 |
| 1.3.2 自给自足型P450单加氧酶的分类 |
| 1.3.3 自给自足型P450单加氧酶对脂肪酸区域选择性的分子改造 |
| 1.4 羟基脂肪酸概述 |
| 1.4.1 羟基脂肪酸的结构和性质 |
| 1.4.2 羟基脂肪酸的应用 |
| 1.4.3 羟基脂肪酸的合成 |
| 1.5 本文研究目的及主要内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 主要内容 |
| 第二章 细胞色素P450单加氧酶的基因挖掘及底物谱筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细菌P450单加氧酶的基因挖掘和生物信息学分析 |
| 2.3.2 序列比对及进化树的构建 |
| 2.3.3 基因组提取 |
| 2.3.4 引物设计 |
| 2.3.5 重组细菌P450单加氧酶表达载体的构建 |
| 2.3.6 重组P450单加氧酶的表达与SDS-PAGE分析 |
| 2.3.7 脂肪酸底物谱测定 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 P450单加氧酶的基因挖掘和生物信息学分析 |
| 2.4.2 序列比对及进化树的构建 |
| 2.4.3 细胞色素P450单加氧酶基因的克隆与表达 |
| 2.4.4 底物谱测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Bamf2522和Bamf0695的纯化表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 P450单加氧酶的蛋白纯化 |
| 3.3.2 P450单加氧酶的光谱学表征 |
| 3.3.3 P450单加氧酶的酶学性质表征 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 P450单加氧酶的纯化 |
| 3.4.2 P450单加氧酶光谱学的表征 |
| 3.4.3 P450单加氧酶的酶学性质的表征 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Bamf0695对脂肪酸羟基化区域选择性的分子改造 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Bamf0695的序列比对、同源建模与分子对接 |
| 4.3.2 引物设计 |
| 4.3.3 突变体的构建 |
| 4.3.4 突变体蛋白的表达及SDS-PAGE分析 |
| 4.3.5 Bamf0695突变体催化脂肪酸区域选择性分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 Bamf0695序列比对与同源建模 |
| 4.4.2 Bamf0695突变位点的选择 |
| 4.4.3 Bamf0695突变体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 4.4.4 Bamf0695突变体对脂肪酸羟基化区域选择性分析 |
| 4.4.5 分子对接分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 Bamf2522对脂肪酸羟基化区域选择性的分子改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.2.3 试剂配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 Bamf2522序列比对、同源建模和分子对接 |
| 5.3.2 引物设计 |
| 5.3.3 Bamf2522突变体的构建 |
| 5.3.4 Bamf2522突变体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 5.3.5 Bamf2522突变体对脂肪酸羟基化区域选择性分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 序列比对与同源建模 |
| 5.4.2 Bamf2522突变位点的选择 |
| 5.4.3 Bamf2522突变体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 5.4.4 Bamf2522突变体对脂肪酸区域选择性分析 |
| 5.4.5 分子对接分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 Bamf2522和Bamf0695催化微藻生物质探究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器与材料 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验材料 |
| 6.2.3 试剂配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 微藻的培养 |
| 6.3.2 微藻中脂肪酸混合物的提取 |
| 6.3.3 气相色谱分析微藻中脂肪酸的组分和含量 |
| 6.3.4 Bamf2522和Bamf0695催化微藻脂肪酸的羟基化 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 微藻中脂肪酸的含量测定及鉴定 |
| 6.4.2 Bamf2522和Bamf0695催化微藻脂肪酸羟基化产物分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）Massilia sp. UMI-21 PHA合成途径中相关酶鉴定及其对PHA合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 聚羟基脂肪酸酯 |
| 1.2.1 PHA结构与性质 |
| 1.2.2 PHA分类 |
| 1.3 PHA应用 |
| 1.3.1 医疗应用 |
| 1.3.2 农业应用 |
| 1.3.3 市场应用 |
| 1.4 PHA生物合成 |
| 1.4.1 PHA生物合成途径 |
| 1.4.2 PHA生物合成相关蛋白 |
| 1.4.3 PHA聚合酶 |
| 1.5 PHA目前面临的问题及研究现状 |
| 1.6 课题研究目的与意义 |
| 第2章 Massilia sp.UMI-21 碳源优化及其产物表征 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 仪器设备与试剂 |
| 2.1.2 试剂与培养基 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 菌株Massilia sp.UMI-21 碳源优化 |
| 2.2.2 产物结构表征 |
| 2.2.3 材料特性分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 菌株Massilia sp.UMI-21 碳源优化 |
| 2.3.2 产物结构表征 |
| 2.3.3 材料特性分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Massilia sp.UMI-21 菌的PHA合成途径解析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌种 |
| 3.1.2 实验仪器及药品 |
| 3.1.3 试剂与培养基 |
| 3.2 Massilia sp.UMI-21 细菌基因组测序及基因注释 |
| 3.2.1 质粒鉴定 |
| 3.2.2 基因组测序及测序数据的处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 质粒鉴定 |
| 3.3.2 测序结果与基因功能 |
| 3.3.3 Massilia sp.UMI-21 PHA合成代谢途径的推测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Massilia sp.UMI-21 淀粉分解酶对PHA合成影响及Pha C的底物特异性鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌种及质粒 |
| 4.1.2 实验仪器及药品 |
| 4.1.3 试剂与培养基 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 Massilia sp.UMI-21 中淀粉分解酶对PHA合成的影响 |
| 4.2.2 Massilia sp.UMI-21中PHA合酶Pha C的底物特异性鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Massilia sp.UMI-21 中淀粉分解酶对合成PHA合成的影响 |
| 4.3.2 Massilia sp.UMI-21中PHA合酶Pha C的底物特异性鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
（3）活性污泥菌群完全矿化磺胺甲恶唑的特性与机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写总览表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 世界水安全的变革与现状 |
| 1.3 磺胺类抗生素概述 |
| 1.3.1 磺胺类抗生素的使用情况 |
| 1.3.2 磺胺类抗生素的残留现状 |
| 1.3.3 磺胺类抗生素的危害与环境风险 |
| 1.4 磺胺类抗生素生物降解研究现状与展望 |
| 1.4.1 厌氧生物降解现状 |
| 1.4.2 缺氧生物降解现状 |
| 1.4.3 好氧生物降解现状 |
| 1.4.4 磺胺类抗生素生物降解研究展望 |
| 1.5 微生物组学常用研究方法概述 |
| 1.5.1 传统扩增子测序 |
| 1.5.2 宏基因组测序 |
| 1.5.3 其它组学手段 |
| 1.5.4 稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP) |
| 1.5.5 分子生态网络(MENs) |
| 1.5.6 实验设计优化——时间进程分析 |
| 1.6 本文的研究背景、目的和意义 |
| 1.7 本文的主要研究内容与技术路线 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 研究技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂及培养基 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 培养基的配置及灭菌方法 |
| 2.2 磺胺甲恶唑及其中间产物降解菌群的定向富集 |
| 2.2.1 磺胺甲恶唑降解菌群的定向富集 |
| 2.2.2 中间产物3-氨基-5-甲基异恶唑降解菌群的定向富集 |
| 2.3 化学测试方法及生长曲线的测定 |
| 2.3.1 样品预处理 |
| 2.3.2 超高效液相色谱法(UPLC) |
| 2.3.3 总有机碳(TOC) |
| 2.3.4 亚硫酸根(SO3~(2-)) |
| 2.3.5 氨氮(NH3-N) |
| 2.3.6 生长曲线的测定 |
| 2.4 磺胺甲恶唑及其中间产物降解菌的分离鉴定 |
| 2.4.1 菌株的分离及保存 |
| 2.4.2 DNA的提取及质检 |
| 2.4.3 16S rRNA基因扩增 |
| 2.4.4 菌株鉴定及形貌表征 |
| 2.5 纯菌菌液预培养 |
| 2.6 细菌基因组测序 |
| 2.6.1 基因组DNA的提取和质控 |
| 2.6.2 基因文库构建与测序 |
| 2.6.3 基因组组装 |
| 2.6.4 基因预测与注释 |
| 2.7 微生物群落相关分析 |
| 2.7.1 富集液总DNA的提取 |
| 2.7.2 16S r RNA基因扩增 |
| 2.7.3 测序数据处理 |
| 2.7.4 微生物群落结构演替 |
| 2.7.5 3-氨基-5-甲基异恶唑降解紧密关联菌属功能验证 |
| 2.7.6 稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP) |
| 2.7.7 分子生态网络(MENs)构建 |
| 2.8 降解动力学模拟 |
| 2.9 统计学分析 |
| 2.9.1 Student t检验 |
| 2.9.2 微生物多样性指数分析 |
| 2.9.3 皮尔森(Pearson)相关性检验 |
| 第3章 活性污泥微生物组对磺胺甲恶唑的分解转化特性与功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 磺胺甲恶唑(SMX)降解菌群的降解特性研究 |
| 3.2.1 SMX降解菌群的定向富集 |
| 3.2.2 SMX降解及中间产物生成 |
| 3.2.3 富集液利用SMX生长情况 |
| 3.2.4 亚硫酸盐(SO_3~(2-))的释放 |
| 3.2.5 总有机碳(TOC)分析 |
| 3.3 3A5MI降解菌群的定向富集及其降解特性研究 |
| 3.3.1 3A5MI降解菌群的定向富集 |
| 3.3.2 3A5MI降解菌群的降解及生长特性研究 |
| 3.4 功能细化菌群的微生物群落结构 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 磺胺甲恶唑及其产物降解核心菌的分离鉴定与功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 纯菌的分离纯化及鉴定 |
| 4.3 核心降解菌的鉴定及其形态表征 |
| 4.4 磺胺甲恶唑及其氧化产物核心降解菌的降解特征 |
| 4.4.1 菌株P27 降解磺胺甲恶唑的特性研究 |
| 4.4.2 菌株N27 降解3-氨基-5-甲基异恶唑的特性研究 |
| 4.5 菌株P27 降解磺胺类抗生素的底物谱 |
| 4.6 核心降解菌基因组 |
| 4.6.1 基因组质量评估 |
| 4.6.2 两株降解纯菌基因组概况 |
| 4.6.3 KEGG氮代谢通路 |
| 4.6.4 基因组BLAST比对 |
| 4.7 Paenarthrobacter sp.P27与Nocardioides sp.N27 复配研究 |
| 4.7.1 纯菌单/共培养与富集液降解效能对比 |
| 4.7.2 纯菌共培养对SMX浓度的适应性 |
| 4.8 本章小结 |
| 第5章 微生物互作驱动磺胺甲恶唑完全矿化机制解析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 好氧生物降解研究方法整合 |
| 5.2.1 样品源的选择 |
| 5.2.2 定向富集 |
| 5.2.3 核心降解菌的分离与高效功能单元判定 |
| 5.2.4 高效功能单元深度降解机制解析 |
| 5.3 磺胺甲恶唑及其产物降解微生物组的群落演替分析 |
| 5.3.1 菌门-菌属水平群落结构演替 |
| 5.3.2 微生物群落演替初识降解活性微生物 |
| 5.3.3 降解动力学联合群落演替揭示活性微生物 |
| 5.3.4 3-氨基-5-甲基异恶唑降解紧密关联菌属功能验证 |
| 5.4 DNA-SIP锁定磺胺甲恶唑-苯环降解活性菌 |
| 5.5 分子生态网络揭示功能微生物组互作关系 |
| 5.5.1 总网络(菌属水平)分析 |
| 5.5.2 网络模块化分析 |
| 5.5.3 核心网络分析 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）不同柑橘种质中聚甲氧基黄酮评价、生物合成相关基因的挖掘与功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文章综述 |
| 1 课题的提出 |
| 2 植物中PMFs的研究进展 |
| 2.1 PMFs的分布和生物学活性 |
| 2.2 PMFs的生物合成 |
| 2.3 柑橘果实中PMFs生物合成的研究进展 |
| 4 本研究的目的和内容 |
| 第二章 不同柑橘种质资源中PMFs的评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用LC-MS与HPLC鉴定柑橘中的PMFs |
| 3.2 代表性柑橘种质PMFs的组织特异性 |
| 3.3 代表性柑橘种质不同发育阶段果实黄皮层中PMFs的动态变化 |
| 3.4 柑橘自然群体PMFs的代谢差异 |
| 3.5 柑橘人工杂交群体子代积累PMFs的表型分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柑橘PMFs代谢的时空特异性 |
| 4.2 含积累特异性PMFs的柑橘种质 |
| 4.3 柑橘PMFs代谢物的种内差异和种间变异 |
| 4.4 柑橘自然种质和人工杂交群体中PMFs遗传机制的差异 |
| 第三章 柑橘中PMFs生物合成相关基因的挖掘与功能验证 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柑橘O-甲基转移酶基因家族的鉴定 |
| 3.2 代谢组结合转录组筛选差异表达基因 |
| 3.3 柑橘中PMFs合成相关OMTs的克隆和表达分析 |
| 3.4 PMFs生物合成关键基因生物学功能验证 |
| 3.5 柑橘OMTs系统进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同柑橘基因组中OMTs数目差异 |
| 4.2 结合转录组和代谢组筛选PMFs生物合成相关基因 |
| 4.3 PMFs的生物合成可能由多种OMT酶和羟基化酶等共同作用 |
| 4.4 植物中次生代谢物生物合成途径相关基因筛选和验证的策略 |
| 第四章 利用红橘×枳F_1杂交群体定位控制PMFs代谢的主效基因 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用BSA-seq定位PMFs生物合成基因的候选区间 |
| 3.2 候选基因CrOMT6的克隆和酶功能验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 次生代谢物生物合成相关基因簇 |
| 4.2 BSA-seq辅助定位次生代谢相关基因 |
| 4.3 多组学筛选柑橘自然群体和人工杂交群体PMFs生物合成相关OMTs |
| 第五章 不同柑橘种质中PMFs合成主效基因的序列变异及相关转录因子的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同柑橘种质中关键基因的序列变异 |
| 3.2 不同柑橘种质中关键基因的同源序列的功能验证 |
| 3.3 基于重测序数据分析不同柑橘种质中3个PMFs合成相关主效OMTs的序列变异 |
| 3.4 几个OMTs基因的启动子序列分析 |
| 3.5 PMFs生物合成相关调控基因的筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同柑橘种质PMFs代谢差异的分子基础 |
| 4.2 PMFs生物合成主效基因OMT的酶活性位点预测 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 附表 |
| 附录Ⅱ 攻博期间发表文章和专利 |
| 致谢 |
（5）番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环氧化物水解酶的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 EHs的分类 |
| 1.1.3 EHs的来源 |
| 1.1.4 EHs的异源表达 |
| 1.1.5 EHs的结构及催化机制 |
| 1.1.6 EHs的两种水解途径 |
| 1.1.7 EHs的产物的应用价值 |
| 1.2 环氧化物水解酶的分子改造 |
| 1.2.1 初级的理性设计 |
| 1.2.2 定向进化 |
| 1.2.3 半理性设计 |
| 1.2.4 计算机辅助蛋白设计 |
| 1.3 环氧化物水解酶的催化体系优化 |
| 1.3.1 添加有机溶剂 |
| 1.3.2 添加非离子表面活性剂 |
| 1.3.3 添加离子溶剂/深共溶溶剂 |
| 1.4 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 番茄环氧化物水解酶的克隆表达及酶学性质分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 生物信息学网站及软件 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验材料与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 番茄EH基因的克隆 |
| 2.3.2 番茄EH表达重组菌的构建 |
| 2.3.3 重组菌E.coli/sleh1的EH活性测定 |
| 2.3.4 SlEH1 的异源表达条件优化 |
| 2.3.5 SlEH1 的酶学性质分析 |
| 2.3.6 同源建模分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 番茄EH基因的克隆 |
| 2.4.2 番茄EH的结构分析 |
| 2.4.3 重组菌E.coli/sleh1 和/sleh2 的构建 |
| 2.4.4 重组菌诱导条件的优化 |
| 2.4.5 SlEH1和SlEH2的纯化分析 |
| 2.4.6 SlEH1和SlEH2的酶学性质分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 番茄环氧化物水解酶的底物谱研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 环氧化物底物的合成 |
| 3.3.2 SlEH1和SlEH2的诱导表达 |
| 3.3.3 E.coli/sleh1和/sleh2的催化活性测定 |
| 3.3.4 SlEH1和SlEH2的反应进程曲线测定 |
| 3.3.5 SlEH1和SlEH2的对映选择性(E值)测定 |
| 3.3.6 SlEH1和 SlEH2的区域选择性(α_S和 β_R)测定 |
| 3.3.7 SlEH1对(R)-2a和(S)-2a动力学参数的测定 |
| 3.3.8 克级规模制备(R)-2a和(R)-4a |
| 3.3.9 SlEH1 对映选择性的分子动力学机理解析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 SlEH1 的底物谱分析 |
| 3.4.2 SlEH2 的底物谱分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于半理性设计调控SlEH1对rac-11a区域选择性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 (R)-11a和(S)-11a的合成 |
| 4.3.2 sleh1突变基因文库及E.coli重组菌的构建 |
| 4.3.3 SlEH1 及其突变酶的表达 |
| 4.3.4 催化活性测定 |
| 4.3.5 筛选归一性提高的突变酶 |
| 4.3.6 区域选择性测定 |
| 4.3.7 克级规模归一性水解rac-11a实验 |
| 4.3.8 SlEH1~(W106T/F189L)的底物谱特性测定 |
| 4.3.9 SlEH1~(W106T/F189L)的动力学参数测定 |
| 4.3.10 SlEH1和(S)-11a分子对接及动力学模拟 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 SlEH1 突变位点的选择 |
| 4.4.2 SlEH1的Smart突变文库的构建 |
| 4.4.3 SlEH1 的单位点突变文库筛选 |
| 4.4.4 SlEH1 的最优突变酶选定 |
| 4.4.5 克级规模归一性合成(R)-11b |
| 4.4.6 SlEH1~(W106T/F189L)的底物谱分析 |
| 4.4.7 分子动力学模拟分析SlEH1~(W106T/F189L)的 α_S值提高机制 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 提高SlEH2归一性制备(R)-1b底物加载量的反应媒介优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 E.coli/sleh2磷酸缓冲液中的最大底物加载量 |
| 5.3.2 有机/磷酸缓冲液反应媒介对E.coli/sleh2 催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.3 添加DESs对 E.coli/sleh2催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.4 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.5 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2区域选择性的影响 |
| 5.3.6 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2产物抑制现象的影响 |
| 5.3.7 E.coli/sleh2归一性制备(R)-1b |
| 5.3.8 最优反应媒介在EHs制备手性邻二醇中的应用 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 E.coli/sleh2在磷酸缓冲液中制备(R)-1b的最大底物加载量 |
| 5.4.2 反应媒介优化提高底物加载量 |
| 5.4.3 E.coli/sleh2在吐温-20/磷酸缓冲液的产物抑制现象分析 |
| 5.4.4 吐温-20/磷酸缓冲液反应媒介在EHs制备手性邻二醇中的广谱性研究 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读博士学位期间发表的成果 |
| 附录2:本文中所用环氧底物信息 |
| 附录3:SlEH1 的单位点突变文库的筛选 |
| 附录4:(R)-11b的GC及核磁分析图谱 |
| 附录5:(R)-1b的GC及核磁分析图谱 |
（6）Aspergillus niger An76木聚糖同工酶降解模式的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木聚糖生物质资源 |
| 1.2 木聚糖的降解转化 |
| 1.2.1 木聚糖降解微生物 |
| 1.2.2 木聚糖降解酶的种类与性质 |
| 1.2.3 木聚糖降解酶基因的多样性 |
| 1.2.4 木聚糖降解酶的协同作用 |
| 1.3 木聚糖酶水解木聚糖资源的应用 |
| 1.3.1 益生元的生产——木寡糖 |
| 1.3.2 发酵产品:木糖醇和生物乙醇 |
| 1.3.3 木聚糖酶在食品和饲料行业中的应用 |
| 1.4 真菌遗传操作系统的建立 |
| 1.4.1 丝状真菌转化方法 |
| 1.4.2 选择性标记 |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 Aspergillus niger An76 GH11木聚糖酶降解模式的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 木聚糖酶的生物信息学分析 |
| 2.1.6 木聚糖酶基因的转录水平测定 |
| 2.1.7 木聚糖酶基因的克隆、表达和纯化 |
| 2.1.8 木聚糖酶活性的测定 |
| 2.1.9 木聚糖酶的变性电泳、活性电泳和亲和电泳 |
| 2.1.10 木聚糖酶的底物特异性和动力学参数的测定 |
| 2.1.11 木聚糖酶降解产物的分析 |
| 2.1.12 木聚糖酶的协同水解实验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 木聚糖酶编码基因的统计分析 |
| 2.2.2 GH11木聚糖酶的系统发育树和序列分析 |
| 2.2.3 GH11木聚糖酶编码基因在不同底物下的定量转录分析 |
| 2.2.4 GH11木聚糖酶的重组表达及酶学性质 |
| 2.2.5 GH11木聚糖酶的降解模式分析 |
| 2.2.6 GH11木聚糖酶活性结构的生物信息学分析 |
| 2.2.7 GH11木聚糖酶之间的协同作用 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 Aspergillus niger An76 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶降解模式的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 阿拉伯呋喃糖苷酶的转录水平测定 |
| 3.1.6 阿拉伯呋喃糖苷酶基因的克隆、表达和纯化 |
| 3.1.7 阿拉伯呋喃糖苷酶活性的测定 |
| 3.1.8 阿拉伯呋喃糖苷酶的底物特异性的测定 |
| 3.1.9 阿拉伯呋喃糖苷酶降解产物的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因的统计分析 |
| 3.2.2 阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因在不同底物下的定量转录分析 |
| 3.2.3 阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及酶学性质 |
| 3.2.4 阿拉伯呋喃糖苷酶的降解模式分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 Aspergillus niger An76遗传操作系统的初建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 抗生素敏感性及浓度的测定 |
| 4.1.6 5'-FOA抑制浓度的测定 |
| 4.1.7 原生质体制备条件的确定 |
| 4.1.8 染色体DNA的提取 |
| 4.1.9 外源DNA片段的PCR扩增及融合 |
| 4.1.10 原生质体的转化 |
| 4.1.11 转化子的筛选及PCR验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 原生质体制备条件的确定 |
| 4.2.2 抗生素敏感性及耐受浓度的确定 |
| 4.2.3 5'-FOA抑制浓度的确定 |
| 4.2.4 外源DNA片段的扩增及转化子筛选 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）海洋褐藻胶裂解酶资源挖掘及特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 褐藻胶 |
| 1.1.1 褐藻胶的来源 |
| 1.1.2 褐藻胶的结构与性质 |
| 1.1.3 褐藻胶的应用 |
| 1.2 褐藻寡糖 |
| 1.2.1 褐藻寡糖的制备 |
| 1.2.2 褐藻寡糖的应用 |
| 1.3 褐藻胶裂解酶 |
| 1.3.1 褐藻胶裂解酶的来源 |
| 1.3.2 褐藻胶裂解酶的分类 |
| 1.3.3 褐藻胶裂解酶的催化机制 |
| 1.3.4 褐藻胶裂解酶的酶活测定方法 |
| 1.3.5 褐藻胶裂解酶的应用 |
| 1.4 本课题的研究内容及意义 |
| 2 褐藻胶降解菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料来源 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株的筛选 |
| 2.2.2 酶活测定方法 |
| 2.2.3 菌种保藏 |
| 2.2.4 可培养菌株的分子鉴定与分析 |
| 2.2.5 产酶条件优化 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 褐藻胶降解菌的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 菌株FG2-1 的生长曲线 |
| 2.3.3 菌株FG2-1 的发酵条件优化 |
| 2.4 讨论及小结 |
| 3 菌株FG2-1 基因组测序分析及生物信息学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株FG2-1 基因组的提取 |
| 3.2.2 菌株FG2-1 基因组测序及组装 |
| 3.2.3 基因组分析常用数据库和分析软件 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株FG2-1 基因组测序分析 |
| 3.3.2 菌株FG2-1 的生物信息学分析 |
| 3.4 讨论及小结 |
| 4 褐藻胶裂解酶的异源表达及酶学性质研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组质粒的构建 |
| 4.2.2 蛋白的异源表达及酶学性质研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 褐藻胶裂解酶基因val1 的扩增与序列分析 |
| 4.3.2 重组褐藻胶裂解酶表达载体的构建及异源表达 |
| 4.3.3 重组褐藻胶裂解酶的蛋白含量分析 |
| 4.3.4 重组褐藻胶裂解酶的酶学性质分析 |
| 4.3.5 重组褐藻胶裂解酶的动力学分析 |
| 4.3.6 重组酶的薄层层析(Thin layer chromatography,TLC)分析 |
| 4.4 讨论及小结 |
| 5 全文总结及展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 主要仪器 |
| 附录 B 常用溶液配制 |
| 附录 C 褐藻胶裂解酶核酸及氨基酸序列 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（8）桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 褪黑素及异构体的概述 |
| 1.1.1 褪黑素的概述 |
| 1.1.2 褪黑素异构体的概述 |
| 1.2 褪黑素及异构体的分布 |
| 1.2.1 褪黑素的分布 |
| 1.2.2 褪黑素异构体的分布 |
| 1.3 褪黑素及异构体的生理功能 |
| 1.3.1 褪黑素在动物体中的功能 |
| 1.3.2 褪黑素在植物中中的功能 |
| 1.3.3 褪黑素异构体的功能 |
| 1.4 植物褪黑素及异构体的生物合成 |
| 1.4.1 褪黑素生物合成路径 |
| 1.4.2 色氨酸脱羧酶(TDC) |
| 1.4.3 色胺5-羟化酶(T5H) |
| 1.4.4 5-羟色胺N-乙酰基转移酶(SNAT) |
| 1.4.5 N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶(ASMT) |
| 1.4.6 咖啡酸-氧-甲基转移酶(COMT) |
| 1.5 桑树中褪黑素研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 2.2.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制解析 |
| 2.2.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析 |
| 3.1 材料的数据 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 3.1.3 主要使用仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同桑树品种资源中褪黑素检测与鉴定 |
| 3.2.2 不同桑树品种资源褪黑素及其异构体总含量变化 |
| 3.2.3 不同采摘季节的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.2.4 不同发育程度的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 本章讨论 |
| 3.3.2 本章小结 |
| 第四章 川桑褪黑素生物合成相关基因的鉴定、克隆与生物信息学分析 |
| 4.1 材料及主要试剂 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 4.1.3 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树褪黑素生物合成相关基因的鉴定 |
| 4.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 4.2.3 川桑褪黑素生物合成相关基因的克隆 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 川桑中褪黑素生物合成相关基因的的序列鉴定 |
| 4.3.2 MnTDC基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.3 MnT5H基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.4 MnSNAT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.5 MnASMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.6 MnCOMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第五章 川桑褪黑素生物合成相关基因表达分析和亚细胞定位 |
| 5.1 材料及主要试剂 |
| 5.1.1 生物材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 5.1.3 主要使用仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在川桑不同组织的表达量 |
| 5.2.2 亚细胞定位引物设计及载体的选择 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 5.2.5 褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 川桑褪黑素生物合成相关基因在不同组织表达分析 |
| 5.3.2 川桑褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第六章 川桑褪黑素生物合成机制研究 |
| 6.1 材料及主要试剂 |
| 6.1.1 生物材料 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 6.1.3 主要使用仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 纯化靶标蛋白 |
| 6.2.3 靶标蛋白酶活测定 |
| 6.2.4 影响酶活因素 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 MnTDC重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.2 MnT5H2重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.3 MnSNAT5重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.4 MnASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.5 MnCOMT1重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第七章 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 7.1 材料及主要试剂 |
| 7.1.1 生物材料 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 7.1.3 主要使用仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在桑树不同组织的表达量 |
| 7.2.3 桑树MaASMT4、MaASMT9、MaASMT16和MaASMT20基因的克隆 |
| 7.2.4 原核表达载体的构建 |
| 7.2.5 纯化靶标蛋白 |
| 7.2.6 靶标蛋白酶活测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 桑树不同组织中褪黑素和异构体的检测与鉴定 |
| 7.3.2 褪黑素生物合成相关基因在桑树组织特异性表达分析 |
| 7.3.3 MaASMT4和MaASMT20在桑树中克隆分析 |
| 7.3.4 MaASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 7.4.1 本章讨论 |
| 7.4.2 本章小结 |
| 第八章 全文总结 |
| 8.1 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 8.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制 |
| 8.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的文章及参研的课题 |
| 致谢 |
（9）酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖及催化机理的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖概述 |
| 1.1.1 N-乙酰氨基葡萄糖结构及理化性质 |
| 1.1.2 N-乙酰氨基葡萄糖的功能及应用 |
| 1.1.3 N-乙酰氨基葡萄糖的制备 |
| 1.2 国内外酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖的研究进展 |
| 1.2.1 几丁质酶 |
| 1.2.2 β-N-乙酰基己糖胺酶 |
| 1.2.3 几丁质水解氧化酶 |
| 1.2.4 应用现状 |
| 1.3 本课题的研究意义 |
| 1.4 本课题的研究内容与思路 |
| 第二章 重组几丁质酶催化降解几丁质的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 培养基及常用溶液的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 几丁质酶的制备 |
| 2.3.2 酶活测定 |
| 2.3.3 几丁质酶的催化特性 |
| 2.3.4 HPLC检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 几丁质酶的酶学性质 |
| 2.4.2 几丁质酶降解几丁质反应 |
| 2.4.3 产物的分离纯化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 β-N-乙酰基己糖胺酶的基因克隆表达及酶学性质分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 培养基及常用溶液的配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 β-N-乙酰基己糖胺酶基因的克隆表达 |
| 3.3.2 β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N的诱导条件优化 |
| 3.3.3 β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N的酶学性质 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 β-N-乙酰基己糖胺酶基因的表达载体构建 |
| 3.4.2 β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N的诱导条件优化 |
| 3.4.3 β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N的酶学性质 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双酶协同催化降解几丁质体系的建立及其催化机制分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 培养基及常用溶液的配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 几丁质酶和β-N-乙酰基己糖胺酶的制备 |
| 4.3.2 几丁质酶和β-N-乙酰基己糖胺酶的酶活测定 |
| 4.3.3 胶体几丁质的制备 |
| 4.3.4 液相色谱(HPLC)检测产物 |
| 4.3.5 质谱检测 |
| 4.3.6 傅里叶红外光谱 |
| 4.3.7 核磁共振 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 双酶协同催化体系的建立 |
| 4.4.2 双酶协同催化机制研究 |
| 4.4.3 N-乙酰氨基葡萄糖的鉴定及结构表征 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 双酶协同催化体系的条件优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 培养基及常用溶液的配置 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 几丁质酶和β-N-乙酰基己糖胺酶的制备 |
| 5.3.2 几丁质酶和β-N-乙酰基己糖胺酶的酶活测定 |
| 5.3.3 外标法测几丁二糖及N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 5.3.4 产物液相色谱(HPLC)检测条件 |
| 5.3.5 胶体几丁质的制备 |
| 5.3.6 双酶协同催化反应条件优化 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 外标法几丁二糖及N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 5.4.2 温度对双酶协同催化体系的影响 |
| 5.4.3 pH对双酶协同催化体系的影响 |
| 5.4.4 底物双酶协同催化体系的影响 |
| 5.4.5 双酶添加比例对协同催化反应的影响 |
| 5.4.6 酶添加量对协同催化反应的影响 |
| 5.4.7 正交实验 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间学术活动及成果情况 |
（10）基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 维生素K |
| 1.1.1 维生素K的发现历程 |
| 1.1.2 维生素K的性质 |
| 1.1.3 维生素K2的功能与应用 |
| 1.1.4 维生素K2的生物合成 |
| 1.2 合成生物学及其应用 |
| 1.2.1 合成生物学的概念 |
| 1.2.2 合成生物学的研究内容 |
| 1.2.3 合成生物学的应用 |
| 1.3 蛋白表达系统 |
| 1.3.1 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本论文研究的内容与意义 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 大肠杆菌四烯甲萘醌生物合成途径的构建与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基和溶液 |
| 2.2.5 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.2.6 利用Red重组系统无痕敲除大肠杆菌pgi基因 |
| 2.2.7 胞内产物的提取和检测 |
| 2.2.8 胞内NADPH含量的检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌pgi基因缺失菌株的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的理性设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 理性设计以VK3和IPP为底物的MK-4生物合成途径 |
| 3.2.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 毕赤酵母MK-4生物合成途径的理性设计 |
| 3.3.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 培养基和溶液 |
| 4.2.5 HsUBIAD1蛋白表达载体的构建 |
| 4.2.6 构建产HsUBIAD1重组毕赤酵母 |
| 4.2.7 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.2.8 高产菌株蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组HsUBIAD1表达载体的构建 |
| 4.3.2 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.3.3 重组HsUBIAD1蛋白表达条件优化 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组HsUBIAD1蛋白的纯化和鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种和质粒 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 培养基和溶液 |
| 5.2.5 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.2.6 重组HsUBIAD1蛋白的酶学分析 |
| 5.2.7 重组GGU-23菌株全细胞催化反应 |
| 5.2.8 异戊烯基化产物的提取与检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.3.2 重组HsUBIAD1蛋白的催化活性 |
| 5.3.3 异戊烯基化产物的鉴定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 毕赤酵母四烯甲萘醌侧链生物合成途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种和质粒 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.2.4 培养基和溶液 |
| 6.2.5 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.2.6 构建PpIDI和SaGGPPS融合表达载体 |
| 6.2.7 构建GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.2.8 筛选GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.3.2 融合表达SaGGPPS和PpIDI强化侧链前体的供给 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 工程菌全细胞催化合成四烯甲萘醌的工艺优化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种和质粒 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 培养基和溶液 |
| 7.2.4 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3.2 工程菌的传代稳定性 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征（论文参考文献）
- [1]自给自足型P450单加氧酶的发现、表征、改造及应用[D]. 宗利. 吉林大学, 2021(01)
- [2]Massilia sp. UMI-21 PHA合成途径中相关酶鉴定及其对PHA合成的影响[D]. 任佳楠. 长春理工大学, 2021(02)
- [3]活性污泥菌群完全矿化磺胺甲恶唑的特性与机制解析[D]. 漆梦媛. 哈尔滨工业大学, 2021
- [4]不同柑橘种质中聚甲氧基黄酮评价、生物合成相关基因的挖掘与功能解析[D]. 彭昭欣. 华中农业大学, 2021(02)
- [5]番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究[D]. 胡博淳. 江南大学, 2021
- [6]Aspergillus niger An76木聚糖同工酶降解模式的研究[D]. 张舒. 山东大学, 2021(12)
- [7]海洋褐藻胶裂解酶资源挖掘及特性研究[D]. 陈琳. 武汉轻工大学, 2021(02)
- [8]桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究[D]. 郑莎. 西南大学, 2021(01)
- [9]酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖及催化机理的研究[D]. 吴昊. 合肥工业大学, 2021(02)
- [10]基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化[D]. 孙小雯. 中国科学技术大学, 2020(01)