论文摘要
藤黄系藤黄科（Guttifera）植物藤黄树（Garcinia hanburyi Hook F.G.）的树干被割伤后所分泌出的胶状树脂,又名玉黄、月黄,始载于《海药本草》。藤黄性寒,味酸、辛、涩,有毒,具破血散结,解毒,止血,杀虫之功效。藤黄外用可治疗痈疽肿毒,顽癣恶疮,溃疡,牙疮蛀齿,肿瘤,跌打损伤,创伤出血及烫伤等,内服可作峻泻剂,治疗水肿,绦虫病。其生品药性峻猛,有毒,具有刺激性,使用不当可产生强烈的头昏、呕吐、腹痛、腹泻等毒性反应,严重时甚至会导致死亡。临床应用均需炮制。藤黄药用始于唐代,炮制方法兴起于清代,由于历史沿革等原因,藤黄炮制方法较为混乱,目前较常见的炮制方法包括清水制、豆腐制及高压蒸制。藤黄经这三种方法炮制后毒性均有所降低,但炮制前后的毒性变化、炮制过程中的成分变化及毒性与成分变化的相关性均未见报道。近年来,藤黄酸类成分作为藤黄的主要毒效成分一直是研究热点。有研究报告认为,藤黄经炮制后的毒性降低与其藤黄酸类成分变化有关。藤黄的解毒机理可能与加入的辅料（豆腐）所具有的解毒作用有关,但清水制法也取得较好的解毒效果,说明通过较长时间的湿热处理、溶解、过滤等过程,使藤黄部分有毒成分有可能被分解破坏,或随水蒸气逸出去或转化为毒性较小的其他成分。由于藤黄炮制方法较为复杂,各方法所用辅料、加热时间、加热温度、加热压力等各有差异,且对毒性无明确有效的毒理评价模型,因此炮制过程中的化学成分变化与炮制解毒是否相关一直不明。本论文以藤黄生品及其各炮制品为研究对象,从藤黄炮制前后的毒性变化和成分变化两方面进行研究。在毒性方面,采用小鼠腹腔炎症模型和大鼠肠粘膜上皮细胞（IEC-6）毒性作用模型,研究藤黄生品和主要炮制品的毒性大小,结果表明藤黄经炮制后,3种炮制品的毒性均有所降低,且与生品组均具有极显著性差异。在成分变化方面,通过比对藤黄生品和各炮制品的总离子流图发现,清水制藤黄图谱的成分变化较为明显,出现4个新增成分；豆腐制藤黄及高压制藤黄的图谱变化相对较小,但也出现了4个新增成分,与清水制藤黄的新增成分相符。通过制备液相,分离制备这4个化合物,鉴定化合物的结构。最后,通过前期筛选的药理模型对新增成分的毒性进行评价。本论文对藤黄炮制减毒作用和成分变化的相关性进行了研究,初步阐明藤黄炮制后毒性下降的部分物质基础,为揭示藤黄的炮制减毒机理提供依据。主要的工作内容包括以下几个方而：1、中药藤黄的毒性研究依据临床中毒症状,分别采用两种整体模型（家兔眼结膜刺激性实验、小鼠腹腔炎症实验）和两种细胞模型（刺激巨噬细胞释放TNF-a含量测定实验、大鼠肠粘膜上皮细胞（IEC-6）毒性实验）评价中药藤黄的毒性。实验结果显示,藤黄生品可引起小鼠的腹腔炎症反应并对大鼠肠粘膜上皮细胞具有显著的增殖抑制作用,对家兔眼结膜无明显刺激且对巨噬细胞释放TNF-a含量无显著影响。因此,将小鼠腹腔炎症模型和大鼠肠粘膜上皮细胞（IEC-6）毒性作用模型作为中药藤黄毒性的评价指标。另对藤黄生品及3种不同炮制品的毒性进行比较,结果显示,与生品组相比,藤黄3种炮制品对小鼠的腹腔炎症反应明显降低,且对大鼠肠粘膜上皮细胞的增殖抑制作用也显著减弱。2、中药藤黄炮制前后成分变化的研究采用快速液相色谱-高分辨质谱联用技术（UFLC-Q-TOF/MS）对藤黄生品及各炮制品的成分进行整体分析。通过对比藤黄生品及各炮制品的总离子流图,发现3种炮制品的成分均发生相应的变化,其中清水制藤黄图谱的成分变化较为明显,豆腐制藤黄及高压制藤黄的图谱变化相对较小,3种炮制品均出现4个相同的新增成分。然后通过Marker View软件对生品组、清水制组、高压制组和豆腐制组四组数据进行主成分分析（PCA）,发现炮制品组与生品组的物质组成均具有显著性差异。与藤黄生品组相比,鉴定出具有统计学意义的差异化合物：清水制品组15个,高压制品组12个,豆腐制品组9个。用制备液相分离精制主要的变化成分（分别命名为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4）,经UV, IR, NMR, MS确证化合物的化合物结构。化合物3和化合物4为藤黄酸的同分异构体,化合物3解析为藤黄烯酸（gambogellic acid）,化合物4解析为表藤黄烯酸（epigambogellic acid）;化合物1和化合物2为加水后的产物,化合物1解析为藤黄醇酸（gambogollic acid）,化合物2解析为表藤黄醇酸（epigambogollic acid）。采用超高效液相色谱法建立了藤黄生品及各炮制品中藤黄酸、新藤黄酸、藤黄烯酸、表藤黄烯酸4个成分同时测定的方法,经方法学考察研究表明,该方法简便,准确,可靠,具有良好的线性、精密度、稳定性和重复性,能够清晰地反应藤黄经炮制后的成分变化情况。3、藤黄炮制过程中主要变化成分的毒性比较采用小鼠腹腔炎症实验和大鼠肠粘膜上皮细胞IEC-6的毒性作用实验对藤黄炮制前后主要变化成分的毒性进行比较。小鼠腹腔炎症实验结果显示,藤黄各单体均能够引起小鼠腹腔的炎症反应,当藤黄酸给药剂量为15 mg·kg-1,给药3h时,其所致炎症反应最强；与藤黄酸和新藤黄酸相比,炮制后的转化成分的致炎作用有所下降,同时新藤黄酸的致炎作用也低于藤黄酸。大鼠肠粘膜上皮细胞IEC-6的增殖抑制作用实验结果显示,藤黄各单体均能够显著抑制大鼠肠粘膜上皮细胞IEC-6的增殖作用,与藤黄酸和新藤黄酸相比,炮制后的转化成分对细胞的增殖抑制作用有所下降,同时新藤黄酸的增殖抑制作用也低于藤黄酸。小鼠腹腔炎症实验和大鼠肠粘膜上皮细胞IEC-6的增殖抑制作用实验结果完全吻合。两种模型综合分析,证明藤黄炮制后的转化成分藤黄烯酸、表藤黄烯酸的毒性确实低于藤黄酸和新藤黄酸,而此结果与藤黄炮制后的毒性下降是吻合的,初步证明藤黄经炮制后毒性降低与成分变化的相关性。本课题通过对有毒中药藤黄的毒性变化和成分变化的研究,以小鼠腹腔炎症模型和大鼠肠粘膜上皮细胞毒性作用模型为基础,探索藤黄炮制前后及炮制过程中主要变化成分的毒性,来考察毒性变化与成分变化的相关性。研究表明藤黄的毒性变化与成分变化确实具有一定的相关性。初步阐明藤黄炮制后毒性下降的部分物质基础,为揭示藤黄的炮制减毒机理提供科学依据。