孤啡肽对大鼠左心室功能的影响及其机制研究

论文摘要

神经肽是一类广泛存在于机体组织且参与多种器官生理功能调节的肽类物质,其对心血管功能的影响一直是研究的热点,孤啡肽（nociceptin, Orphanin FQ,OFQ）即是其中之一。孤啡肽是一种结构类似于κ阿片受体的内源性配体-强啡肽A的十七肽,但它与阿片类受体的亲和力很低,其特异性受体为ORL1受体,与阿片受体有很高的同源性,同属于G蛋白耦联受体超家族。在中枢及外周应用孤啡肽均可引起一定程度的血压下降和心率减慢,研究认为除与孤啡肽参与中枢和外周神经对心血管的调节有关外,还可能与其直接作用于心血管有关。目前在急性心肌缺血及心衰的研究中发现心肌与血浆中孤啡肽含量增高,提示孤啡肽可能参与上述病理过程,但是目前对其作用机制尚不清楚。孤啡肽是否对心功能有直接的调节作用?以及作用的机制如何?我们对此做了进一步的研究。目的:研究孤啡肽对大鼠心脏功能的影响及其可能机制,以期进一步阐述对孤啡肽参与调节心脏生理功能的认识。方法:本实验从四个方面进行研究1.大鼠应用孤啡肽（静脉注射）的在体研究:健康大鼠分为对照组（静脉给予等体积生理盐水）、不同浓度孤啡肽1nM组、10nM组和50nM组,采用颈动脉插管逆行置入左心室,观察给药前后LVSP、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、HR的变化。进一步选用孤啡肽拮抗剂UFP-101与孤啡肽配伍给药,观察上述指标的变化。2.孤啡肽及其受体的免疫荧光化学标定实验:采用组织免疫荧光观察观察孤啡肽及其受体在大鼠心肌中的分布;并且采用急性分离大鼠心肌细胞使用Confocal方法观察孤啡肽受体的分布。3.孤啡肽对心肌细胞的L型钙通道、内向整流钾通道及瞬时外向钾通道研究:采用膜片钳技术,观察不同浓度的孤啡肽对上述离子通道功能的影响,以探讨孤啡肽对心脏作用可能的机制。4.孤啡肽对心肌细胞PKA活性的影响:提取分别经不同浓度OFQ处理的心肌细胞蛋白,采用PKA活性分析试剂盒测定其活化程度,以探讨孤啡肽作用可能的分子机制。结果:1.静脉给予孤啡肽引起大鼠LVSP、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、HR有明显的剂量依赖性抑制（P<0.05）,预先应用孤啡肽的拮抗剂UFP-101可以阻断此作用。2.免疫荧光组织化学显示在大鼠心肌组织中有孤啡肽及其受体存在而confocal结果进一步证实心肌细胞分布有孤啡肽受体。3.膜片钳实验结果显示,孤啡肽对心肌细胞L型钙电流有明显的抑制作用,但没有明显的剂量依赖性,以1nM孤啡肽的作用最为明显（抑制率为22.7%,P<0.05）,UFP-101可以阻断此抑制作用。而孤啡肽对内向整流钾电流和瞬时外向钾电流均没有明显影响。4.心肌细胞PKA活性分析显示,孤啡肽对心肌细胞的PKA没有明显影响。给予Forskolin处理心肌细胞可以明显增高PKA活性,而孤啡肽并不能抑制这种PKA活性的增高,提示可能孤啡肽对心肌细胞的影响并不是通过PKA机制。结论:孤啡肽对大鼠心脏左心室收缩与舒张功能有明显的抑制作用,此作用可能是通过孤啡肽-孤啡肽受体作用,引起心肌细胞L型钙电流的抑制所致。进一步的研究显示孤啡肽对于心肌细胞的PKA活性没有影响,提示可能孤啡肽的这种作用不是通过影响cAMP-PKA通路介导的。对于心肌细胞的内向整流钾电流和瞬时外向钾电流并未见孤啡肽对其有明显影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 前言
• 第一部分 静脉应用孤啡肽对大鼠心功能的影响
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 实验程序
• 1.2.3 统计分析
• 1.3 结果
• 1.3.1 左心室功能各指标及其意义
• 1.3.2 孤啡肽对左心室功能的影响
• 1.3.3 OFQ 对HR 影响
• 1.3.4 孤啡肽受体拮抗剂UFP-101 对左室各指标和心率的影响
• 1.4 讨论
• 第二部分 大鼠心肌孤啡肽及其受体的免疫荧光化学研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 大鼠心肌组织免疫荧光化学检测
• 2.2.3 大鼠急性分离心肌细胞免疫荧光化学检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 大鼠心肌组织孤啡肽受体的表达
• 2.3.2 心肌组织孤啡肽的表达
• 2.4 讨论
• Ca-L、I_k1和I_to的影响'>第三部分 孤啡肽对大鼠心室肌细胞I_Ca-L、I_k1和I_to的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 细胞分离
• 3.2.3 全细胞膜片钳记录（Whole cell recording）
• 3.2.4 实验分组
• 3.2.5 统计学处理
• 3.3 结果
• Ca-L 的影响'>3.3.1 OFQ 对大鼠心肌细胞I_Ca-L的影响
• 3.3.2 OFQ 对大鼠心肌细胞L-型钙离子通道I-V 曲线的影响
• k1 的影响'>3.3.3 OFQ 对大鼠心肌细胞I_k1的影响
• to 的影响'>3.3.4 OFQ 对大鼠心室肌细胞I_to的影响
• Ca-L 的影响'>3.3.5 拮抗剂UFP-101 对OFQ 在大鼠心肌I_Ca-L的影响
• 3.4 讨论
• 第四部分 孤啡肽对心肌细胞PKA 活性的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 优化反应体系中样品的量
• 4.3.2 不同浓度OFQ 作用不同时间对心肌细胞PKA 活性的影响
• 4.3.3 OFQ 对forskolin 刺激心肌细胞PKA 活性的影响
• 4.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 另附：曲马多心肌保护的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 附图
• 参考文献
• 综述孤啡肽及其受体的研究进展
• 1. 孤啡肽及其受体的发现
• 2. 孤啡肽和其受体的结构
• 3. 孤啡肽及其受体在体内的分布
• 4. 孤啡肽生物学功能
• 5. ORL1 受体胞内信号通路
• 6. OFQ 高效类似物
• 7. 结论及展望
• 8. 参考文献
• 个人简介
• 致谢