论文摘要
毛囊干细胞（hair follicle stem cells）是位于毛囊bulge区的一群具有慢周期性、高度增殖潜能和自我更新能力的未分化或低分化细胞。该细胞体外克隆形成能力强,损伤或某些生长因素刺激后可产生短暂增殖细胞（TA细胞）以维持组织的自我更新和修复。Oshima等[1]用遗传工程学的方法进行了表达β半乳糖苷酶的小鼠的毛囊研究,证实毛囊干细胞的bulge定位,同时也提出毛囊bulge部位的干细胞不仅在毛囊周期性生长中起重要作用,同时也是表皮自我更新的细胞来源。由毛囊干细胞分裂产生的短暂增殖细胞亦可上行至皮脂腺,在维持皮脂腺方面发挥作用[2],[3]。近年来,对毛囊及其周期[4]的研究发展十分迅速,对毛囊的了解及其干细胞的定位也更加清楚。而致力于毛囊干细胞的体外鉴定纯化以期最终建系的研究也开始了探索[5]。角膜的损伤修复由于存在角膜来源有限以及异体排斥等问题,因此部分实验室转向经由细胞转分化途径以期获得新的角膜来源,目前,国内外角膜修复相关的转分化研究均取得了不同程度的进展[6],[7],[8]。本实验基于本室以往的研究,于体外用角膜缘组织匀浆液对毛囊bulge细胞进行诱导培养,探讨毛囊干细胞体外诱导转分化为角膜上皮样细胞的可行性。主要研究方法和结果如下:①毛囊干细胞的组织学定位采用免疫组织化学技术,用CD34、α6-integrin等毛囊干细胞干细胞标记物阳性染色对毛囊干细胞进行组织学定位。CD34以及α6-integrin在毛囊隆突区以及其他毛囊外根鞘区皆阳性表达,这表明毛囊干细胞主要存在于毛囊隆突区。②毛囊干细胞的培养和鉴定无菌条件下取SD大鼠触须部皮肤,D-Hanks液（含双抗:青、链霉素）清洗。分离并培养毛囊bulge组织块。待有细胞爬出生长时即行换液,以后每隔1～2天换液以保证细胞良好生长。当生长的细胞达80%融合时,即行传代并同步做细胞爬片培养用于细胞表型鉴定,剩余细胞用于条件诱导培养。取爬片培养的bulge细胞,做免疫细胞化学（ICC法）鉴定检测CD34、α6-integrin以及角膜上皮细胞标记物K12的表达情况。毛囊干细胞标记物CD34、α6-integrin染色阳性。而角膜上皮细胞标记物K12染色阴性。这说明本部分实验成功培养毛囊干细胞。③角膜上皮细胞的定位、培养及鉴定采用免疫组织化学方法,用K12阳性染色对角膜上皮细胞进行组织学定位。阳性染色主要位于角膜上皮的最外一层。无菌条件下取SD大鼠眼球,D-Hanks液（含双抗:青、链霉素）清洗。分离并培养角膜。待发现有细胞爬出生长时即行换液,以后每隔1～2天换液以保证细胞良好生长。待细胞生长足量时,采用免疫细胞化学方法,用角膜上皮细胞标记物K12阳性染色对角膜上皮细胞进行鉴定。④毛囊干细胞的诱导转分化及转分化后的鉴定制备诱导转分化的条件培养基,并对培养的毛囊干细胞的进行诱导转分化。诱导培养过程中据细胞生长情况进行细胞传代,并做部分爬片培养。爬片培养的细胞片用ICC鉴定K12表达情况。并分别用RT-PCR检测K12的基因表达情况、流式细胞方法（FCM）检测诱导后的转分化的阳性细胞率。结果显示:诱导后的细胞阳性表达角膜上皮细胞标记物K12,且角蛋白K12的mRNA也有明显表达,经FCM检测,诱导后细胞K12阳性细胞率可达99.78%。本实验成功地诱导毛囊干细胞转分化为角膜上皮样细胞,为组织工程和角膜的临床修复提供了新的思路。